董永強(qiáng) 夏雪竹△ 劉翠紅 管 濤 陳占功

（1.北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京 100069；3.北京醫(yī)院國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心，北京 100730）

二冬膏是我國(guó)經(jīng)典的滋陰養(yǎng)肺方，由天冬、麥冬組成，用于治療肺陰不足引起的燥咳痰少、痰中帶血、鼻干咽痛，具有抗炎、增強(qiáng)免疫等藥理作用［1］。研究表明，二冬膏能夠減輕急性肺損傷大鼠肺組織水腫，改善肺部病理炎癥［2］。急性肺損傷是由各種直接或間接致傷因素導(dǎo)致的肺組織結(jié)構(gòu)和功能的損傷，主要表現(xiàn)為大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮細(xì)胞屏障功能紊亂［3］。其中肺泡巨噬細(xì)胞是推動(dòng)急性肺損傷病理進(jìn)程的關(guān)鍵細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞的募集、活化是導(dǎo)致肺部炎性因子大量釋放的重要誘導(dǎo)因素［4-5］。為了進(jìn)一步研究二冬膏改善急性肺損傷肺部炎癥的作用，本文以LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞為對(duì)象，考察二冬膏含藥血清對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞中一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細(xì)胞介素-6（IL-6）的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠40只，雌雄不拘，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)于12 h光照和12 h黑暗光照周期的環(huán)境內(nèi)，自由飲食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（24±2）℃。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試藥與儀器 二冬膏按《中國(guó)藥典》（2015年版）配方制備，由天冬和麥冬等比例組成，加水煎煮3次后合并煎液，過(guò)濾、濃縮后與煉蜜混合呈黃棕色濃稠煎膏劑，生藥質(zhì)量濃度為1.0 g/mL。天冬、麥冬均購(gòu)于亳州中藥材市場(chǎng)。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；脂多糖（LPS）、MTT［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide］購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；TRIzon總RNA提取試劑購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；iTaqTMUniversal SYBR Green supermix購(gòu)于美國(guó)BIO-RAD公司；5×all in one RT-MasterMix購(gòu)于上海斯信生物科技有限公司；NO測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；小鼠TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)于南京翼飛雪生物科技有限公司；一抗水通道蛋白1（AQP1）、Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子（MyD88）、核轉(zhuǎn)錄因子κB p65（NF-κB p65）、β肌動(dòng)蛋白（β-actin）及二抗HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（H+L）購(gòu)于沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠肺泡巨噬細(xì)胞MH-S細(xì)胞（美國(guó)ATCC）于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞接種于96孔板或6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 含藥血清制備 40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：空白組、二冬膏低劑量組（2 g/kg）、二冬膏中劑量組（4 g/kg）、二冬膏高劑量組（8 g/kg）。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始灌胃給藥，每日2次，空白對(duì)照組給予10 mL/kg生理鹽水。連續(xù)給藥3 d后，在末次給藥1 h后腹主動(dòng)脈取血，每只大鼠采血量約為5 mL，血液室溫下靜置2 h后，于3 000 r/min下離心10 min，取同組上層血清混勻后即得二冬膏含藥血清。

1.5 MH-S細(xì)胞活力檢測(cè) 采用MTT法檢測(cè)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MH-S細(xì)胞制成5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸浮液，接種于96孔板中，每孔100 μL，隨行設(shè)置空白對(duì)照孔（只含100 μL培養(yǎng)基）。6 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入180 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，調(diào)零孔每孔加入20 μL不含血清培養(yǎng)基，其余各孔分別加入20 μL含藥血清，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液（0.5 mg/mL）100 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，充分溶解反應(yīng)產(chǎn)物后，于490 nm處測(cè)定吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blotting法檢測(cè)MH-S細(xì)胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65及AQP-1蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MH-S細(xì)胞制成1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸浮液，接種于6孔板中，每孔2 mL。接種6 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入1 800 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，空白孔及模型孔加入空白組大鼠血清200 μL，其余孔分別加入二冬膏低、中、高劑量含藥血清200 μL，模型組及二冬膏各劑量組每孔另加0.5 mg/mL的LPS溶液2 μL。另設(shè)一孔加入200 μL PBS作為陰性對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，無(wú)菌管收集細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行細(xì)胞因子的檢測(cè)。細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次后，每孔加入含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液100～150 μL，裂解后將細(xì)胞小心刮下離心取上清，BCA法檢測(cè)細(xì)胞蛋白的濃度。調(diào)整蛋白濃度，取相同總量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后用4%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST清洗后加入一抗稀釋液于4℃孵育過(guò)夜，TBST清洗后加入二抗稀釋液室溫孵育2 h，TBST清洗后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。采用Image Pro-Plus 6.0軟件分析電泳條帶灰度值，以目的蛋白與β-actin灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 RT-PCR檢測(cè)MH-S中TNF-α、IL-6及AQP-1 mRNA表達(dá) 按照上述方法進(jìn)行MH-S細(xì)胞的接板、給藥。給藥24 h后，棄去上清液，用預(yù)冷的無(wú)菌PBS緩沖液洗滌2次，加入TRIzon總RNA提取試劑提取RNA。RNA逆轉(zhuǎn)錄參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將試劑混勻，放入逆轉(zhuǎn)錄儀器中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄所得產(chǎn)物直接進(jìn)行熒光定量PCR，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)在專用低位PCR反應(yīng)孔板中加入相關(guān)反應(yīng)物，引物序列見(jiàn)表1，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參，所得結(jié)果將原始值進(jìn)行2-ΔΔCt轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

表1 引物序列

1.8 細(xì)胞上清液NO、TNF-α及IL-6含量的檢測(cè) 按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算各細(xì)胞因子的含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，采用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組MH-S細(xì)胞存活率的比較 見(jiàn)表2。與空白組相比，二冬膏低、中、高劑量組在干預(yù)24 h內(nèi)對(duì)MHS細(xì)胞的存活率沒(méi)有明顯影響（P＞0.05）。

表2 各組MH-S細(xì)胞存活率的比較（%，±s）

表2 各組MH-S細(xì)胞存活率的比較（%，±s）

組別n 6 h 12 h 24 h 3 3 3 3空白組二冬膏低劑量組二冬膏中劑量組二冬膏高劑量組100.00 101.73±1.22 98.03±2.67 97.07±1.89 100.00 98.37±3.06 100.67±3.56 98.13±3.27 100.00 99.33±2.14 96.07±3.30 97.63±2.49

2.2 各組MH-S細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)水平比較 見(jiàn)表3。與空白組相比，LPS刺激MH-S細(xì)胞24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO、TNF-α及IL-6的含量明顯升高（P＜0.01）。二冬膏能不同程度地降低MH-S細(xì)胞NO、TNF-α及IL-6的分泌量，并呈一定的劑量依賴關(guān)系，但各劑量間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組MH-S細(xì)胞分泌NO、TNF-α及IL-6比較（±s）

表3 各組MH-S細(xì)胞分泌NO、TNF-α及IL-6比較（±s）

與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。下同

組 別n NO（μmol/L）TNF-α（μg/L）IL-6（μg/L）3 3 3 3 3空白組模型組二冬膏低劑量組二冬膏中劑量組二冬膏高劑量組5.67±1.72**35.07±6.75 25.50±2.90 18.20±2.84*12.23±1.40**65.63±7.11**232.43±40.89 183.33±13.84 146.60±12.73*99.07±8.30*32.57±4.52**156.20±25.60 103.77±9.76*82.17±12.09*71.93±5.26*

2.3 各組MH-S細(xì)胞中TNF-α、IL-6及AQP-1 mRNA的比較 見(jiàn)表4。與空白組相比，LPS刺激MH-S細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)量明顯升高（P＜0.01），AQP-1的表達(dá)量明顯下降（P＜0.01）。給予二冬膏含藥血清后，MH-S細(xì)胞中TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），而AQP-1 mRNA的表達(dá)量明顯回升（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 各組MH-S細(xì)胞中TNF-α、IL-6及AQP-1 mRNA的比較（±s）

表4 各組MH-S細(xì)胞中TNF-α、IL-6及AQP-1 mRNA的比較（±s）

組別空白組模型組二冬膏低劑量組二冬膏中劑量組二冬膏高劑量組n 3 3 3 3 3 TNF-α 1.06±0.06**2.12±0.10 1.81±0.08*1.52±0.14**1.28±0.11**IL-6 1.02±0.02**2.35±0.20 1.88±0.12*1.72±0.09*1.51±0.03**AQP-1 1.90±0.12**1.02±0.03 1.23±0.07*1.49±0.04**1.65±0.10**

2.4 各組MH-S細(xì)胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65及AQP-1蛋白的比較 見(jiàn)圖1，表5。與空白組相比，LPS刺激MH-S細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白水平明顯升高（P＜0.01），AQP-1蛋白水平明顯降低（P＜0.01）。給予二冬膏中劑量含藥血清后，MH-S細(xì)胞中TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白水平明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），而AQP-1蛋白水平明顯升高（P＜0.01）。

表5 各組MH-S細(xì)胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65及AQP-1相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表5 各組MH-S細(xì)胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65及AQP-1相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

組別空白組模型組二冬膏中劑量組n 3 3 3 TLR4 0.25±0.07**1.12±0.10 0.48±0.11**MyD88 0.16±0.05**0.91±0.19 0.46±0.10*NF-κB p65 0.07±0.02**0.49±0.12 0.25±0.04*AQP1 0.82±0.22**0.08±0.02 0.37±0.08**

圖1 各組MH-S細(xì)胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65及AQP-1表達(dá)

3 討 論

肺泡巨噬細(xì)胞是肺部巨噬細(xì)胞的主要組成部分，是肺組織抵御外部侵襲的第一道防線，在維持肺部免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［6］。肺組織在受到外源性或內(nèi)源性的致病因素刺激時(shí)，肺泡巨噬細(xì)胞會(huì)大量募集并分泌大量炎性介質(zhì)，形成肺組織局部炎癥微環(huán)境［7］。在炎性環(huán)境下，巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體表達(dá)增加，激活下游相關(guān)通路，進(jìn)一步促進(jìn)炎性因子的分泌與釋放。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，肺泡巨噬細(xì)胞參與急性肺損傷、慢性阻塞性肺病、支氣管哮喘、肺纖維化等多種肺部疾病［8-12］，提示肺泡巨噬細(xì)胞在這些疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色。

二冬膏最早載于《攝生秘剖》，是由天冬和麥冬等比例混合經(jīng)水煎、濃縮與煉蜜混合的黃棕色稠厚煎膏劑，具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺的功效，用于治療肺陰不足引起的燥咳痰少、痰中帶血、鼻干咽痛［13］。研究發(fā)現(xiàn)，二冬膏能夠抑制肺腫瘤發(fā)生、肺癌細(xì)胞A549增殖、改善LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷，減輕肺組織的炎性損傷［2，14-15］。NO主要由巨噬細(xì)胞中的一氧化氮合酶催化合成，NO的過(guò)度釋放會(huì)造成周圍正常細(xì)胞的損傷［16］。TNF-α和IL-6均為炎癥反應(yīng)中的重要細(xì)胞因子，TNF-α能夠激活NF-κB和JNK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的過(guò)程；IL-6能夠激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增生和分化，參與免疫調(diào)節(jié)，引起免疫性病理?yè)p傷［17］。本文考察二冬膏含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞MH-S的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二冬膏含藥血清能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NO、IL-6及TNF-α等炎性介質(zhì)的分泌量，并能抑制IL-6及TNF-α mRNA的表達(dá)，提示二冬膏具有改善炎癥反應(yīng)的作用。

Toll樣受體（TLRs）主要分布于動(dòng)物體內(nèi)的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面。TLRs能夠直接識(shí)別并結(jié)合病原體或其產(chǎn)物，引發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放［18］。TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的首個(gè)TLRs蛋白，其與相應(yīng)配體結(jié)合后，能進(jìn)一步激活NF-κB，從而促進(jìn)各種炎性因子基因表達(dá)的激活。細(xì)胞表面的TLR4受體被激活后，能與MyD88蛋白的羧基端結(jié)合，進(jìn)而激活NF-κB通路，誘導(dǎo)IL-6及TNF-α等炎性因子的表達(dá)［19］。AQP1在維持肺部液體平衡中起到重要作用，研究發(fā)現(xiàn)在LPS所致的急性肺損傷中，劇烈的炎癥反應(yīng)造成肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞受損使肺組織AQP1表達(dá)急劇下降。AQP1蛋白主要存在于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中，但巨噬細(xì)胞膜上AQP1的減少能夠明顯影響巨噬細(xì)胞的吞噬功能，加重炎癥反應(yīng)［20］。本文研究發(fā)現(xiàn)，二冬膏含藥血清能夠改善由LPS導(dǎo)致的AQP1的下調(diào)，同時(shí)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而抑制炎性因子的表達(dá)與釋放。

綜上所述，二冬膏含藥血清能夠通過(guò)上調(diào)AQP1，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，從而抑制炎性因子的表達(dá)及釋放，達(dá)到抗炎作用。