溫秀梅 蔡丹莉 嚴(yán)茂祥 何瓊笑 王 斌

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江 杭州 310005；2.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310018）

重癥急性胰腺炎（SAP）易發(fā)生組織壞死，影響全身重要臟器功能，其中肺是最易累及的器官。調(diào)查顯示，肺損傷是導(dǎo)致SAP患者死亡的重要原因［1］，因此，治療和預(yù)防急性肺損傷對(duì)降低SAP死亡率及改善疾病預(yù)后具有重要意義。SAP肺損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，到目前為止，對(duì)SAP肺損傷的治療仍然有限［2］。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白原樣2（FGL2）凝血酶原酶與SAP的發(fā)病密切相關(guān)，且參與急性重癥呼吸系統(tǒng)綜合征［3-5］。大黃素是大黃的主要有效單體之一，在急性胰腺炎治療中發(fā)揮了多方面作用［6-7］。項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)大黃素可有效抗SAP肺損傷，其機(jī)制可能與其調(diào)控Notch/Hes信號(hào)通路促進(jìn)肺組織炎癥細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)肺組織中TLR4和TLR9的表達(dá)有關(guān)［8-9］。為進(jìn)一步研究大黃素抗SAP肺損傷的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以FGL2凝血酶原酶為切入點(diǎn)，探討大黃素通過(guò)調(diào)節(jié)凝血功能抗SAP相關(guān)肺損傷的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Sprague-Dawley（SD）大鼠120只，雄性，SPF級(jí)，230～250 g，由上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 藥物與試劑 牛磺膽酸鈉：純度＞95%，為美國(guó)Sigma-Aldrich公司提供（產(chǎn)品號(hào)：86339）；大黃素：純度＞90%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供，臨用前以4%蔗糖脂肪酸酯配成大黃素混懸液；總RNA純化提取試劑盒（產(chǎn)品號(hào)：9767）、cDNA合成試劑盒（產(chǎn)品號(hào)：RR036A）、SYBR Premix Ex Taq? Ⅱ（TliRNaseH Plus）（產(chǎn)品號(hào)：RR820A）為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；全蛋白提取試劑盒（產(chǎn)品號(hào)：KGP2100）為江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；BCA定量試劑盒（產(chǎn)品號(hào)：PQ0012）、Rat TNF-α High sensitivity ELISA Ki（t產(chǎn)品號(hào)：EK382HS）為杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；FGL2鼠單抗（產(chǎn)品號(hào)：H00010875）為Abnova公司產(chǎn)品；血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）ELISA試劑盒為南京建成生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 造模與干預(yù) 120只大鼠隨機(jī)數(shù)字法分為5組：假手術(shù)組、模型組、大黃素高劑量組、大黃素中劑量組、大黃素低劑量組各24只，每組又分3、6、12 h 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)8只。假手術(shù)組僅開(kāi)腹暴露并輕微翻動(dòng)胰腺組織后即關(guān)腹。其余4組采用開(kāi)腹胰膽管逆行注射3.5%牛磺膽酸鈉的方法造模建立SAP肺損傷模型。大黃素高、中、低劑量組在造模前和造模后1 h分別腹腔注射大黃素混懸液40、20、10 mg/kg（大黃素劑量根據(jù)文獻(xiàn)及前期預(yù)試［6-7］選擇），假手術(shù)組和模型組在造模前和造模后1 h腹腔注射等量的（和大黃素各組相同容積的）4%蔗糖脂肪酸酯溶液。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè)

各組大鼠分別在造模后3、6、12 h處死大鼠并分離肺組織。1）采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織FGL2凝血酶原酶、TNF-α mRNA表達(dá)；2）免疫組化技術(shù)檢測(cè)FGL2凝血酶原酶蛋白表達(dá)；3）采用蛋白提取試劑盒提取肺組織全蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，ELISA檢測(cè)大鼠肺組織蛋白提取物的TNF-α水平；4）以生理鹽水制備肺組織勻漿，取上清液采用ELISA檢測(cè)TXB2、6-Keto-PGF1α的水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，正態(tài)分布（非正態(tài)分成轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布）采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD進(jìn)行兩兩比較，方差不齊性采用Dunnett′s T3采用進(jìn)行兩兩比較；計(jì)量資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織FGL2 mRNA和蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表1～表2，圖1。模型組3、6、12 h 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)大鼠肺組織FGL2 mRNA和蛋白表達(dá)較假手術(shù)組同一時(shí)相點(diǎn)明顯增高（P＜0.01）；大黃素高、中劑量組各時(shí)相點(diǎn)以及大黃素低劑量組3、6 h時(shí)相點(diǎn)FGL2 mRNA和蛋白表達(dá)較模型組同一時(shí)相點(diǎn)明顯下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），大黃素高劑量組12 h時(shí)相點(diǎn)FGL2 mRNA和蛋白表達(dá)較大黃素低劑量組同一時(shí)相點(diǎn)明顯下調(diào)（P＜0.05）。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織FGL2 mRNA表達(dá)比較（±s）

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織FGL2 mRNA表達(dá)比較（±s）

與假手術(shù)組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與大黃素高劑量組比較，#P＜0.05。下同

組別n 3 h 6 h 12 h 24 24 24 24 24假手術(shù)組模型組大黃素高劑量組大黃素中劑量組大黃素低劑量組1.16±0.13 1.59±0.30**1.20±0.25△△1.16±0.19△△1.17±0.34△△1.07±0.46 2.66±0.64**1.18±0.42△△1.34±0.23△1.36±0.20*△1.02±0.20 2.68±0.53**1.54±0.34**△△1.71±0.50**△△2.14±0.60**#

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織FGL2蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織FGL2蛋白表達(dá)比較（±s）

組別n 3 h 6 h 12 h 24 24 24 24 24假手術(shù)組模型組大黃素高劑量組大黃素中劑量組大黃素低劑量組1.12±0.99 3.69±0.65**2.56±0.73**△2.62±0.69**△2.87±0.58**△1.25±0.89 4.12±0.83**2.69±0.70**△△2.94±0.78**△3.00±0.80**△1.56±0.42 4.31±0.70**2.75±0.60**△△3.00±0.65**△△3.44±0.90**#

圖1 各組大鼠肺組織FGL2蛋白表達(dá)比較（免疫組化染色，100倍）

2.2 各組大鼠肺組織TXB2、6-Keto-PGF1α水平及TXB2/6-Keto-PGF1α比值比較 見(jiàn)表3。模型組3、6、12 h 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)大鼠肺組織TXB2水平及TXB2/6-Keto-PGF1α比值較假手術(shù)組同一時(shí)相點(diǎn)明顯增高（P＜0.01），6-kKeto-PGF1α水平與假手術(shù)組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；大黃素高、中劑量組各時(shí)相點(diǎn)TXB2水平及TXB2/6-Keto-PGF1α比值較模型組同一時(shí)相點(diǎn)明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），大黃素低劑量組6、12 h時(shí)相點(diǎn)TXB2水平以及12 h時(shí)相點(diǎn)TXB2/6-Keto-PGF1α較模型組同一時(shí)相點(diǎn)明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）；大黃素高、中、低劑量組各時(shí)相點(diǎn)6-Keto-PGF1α水平與模型組同一時(shí)相點(diǎn)差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織TXB2、6-Keto-PGF1α、TXB2/6-keto-PGF1α水平比較（±s）

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織TXB2、6-Keto-PGF1α、TXB2/6-keto-PGF1α水平比較（±s）

組別假手術(shù)組（n=8）模型組（n=8）大黃素高劑量組（n=8）大黃素中劑量組（n=8）大黃素低劑量組（n=8）時(shí)間3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h TXB2（pg/mg）57.22±18.04 54.58±15.22 61.24±21.91 106.73±21.46**130.10±33.23**136.03±17.35**76.73±26.68△86.14±22.06*△△89.48±26.80**△△80.74±18.54*△92.38±26.32*△96.31±19.92*△△90.89±18.91*100.28±24.83**△109.61±22.18*△6-Keto-PGF1α（pg/mg）4 361.99±703.78 4 871.38±573.00 4 656.75±797.94 4 970.08±506.59 5 415.67±562.55 5 590.39±401.27 5 103.44±827.39 5 521.65±790.87 5 588.72±520.98 5 147.14±685.22 5 302.54±663.63 5 425.15±701.21 5 037.07±400.54 5 467.94±767.50 5 445.91±715.01 TXB2/6-keto-PGF1α 0.013±0.003 0.011±0.002 0.013±0.004 0.021±0.003**0.024±0.004**0.024±0.004**0.015±0.003△0.015±0.002*△△0.016±0.003△△0.016±0.004△0.017±0.003**△△0.018±0.002*△△0.018±0.005*0.019±0.003**△△0.020±0.002*△

2.3 各組大鼠肺組織TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表4～表5。模型組3、6、12 h 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)大鼠肺組織TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組同一時(shí)相點(diǎn)明顯增高（P＜0.01）；大黃素高、中、低劑量組各時(shí)相點(diǎn)TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)較模型組同一時(shí)相點(diǎn)均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織TNF-α mRNA表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織TNF-α mRNA表達(dá)比較（±s）

組別正常組模型組大黃素高劑量組大黃素中劑量組大黃素低劑量組n 8 8 8 8 8 3 h 1.27±0.13 2.14±0.87*1.24±0.64△△1.26±0.45△1.31±0.40△6 h 1.02±0.21 2.42±0.62**1.19±0.32△△1.42±0.38*△△1.40±0.65△△12 h 1.06±0.40 2.57±0.46**1.44±0.30*△△1.62±0.60**△△1.78±0.56**△

表5 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織TNF-α水平比較（pg/mg，±s）

表5 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織TNF-α水平比較（pg/mg，±s）

組別假手術(shù)組模型組大黃素高劑量組大黃素中劑量組大黃素低劑量組n 8 8 8 8 8 3 h 5.38±0.34 8.89±0.36**6.61±0.54**△△6.33±0.65*△△7.11±1.15*△6 h 5.45±0.22 9.73±0.49**6.91±1.01*△△7.08±0.68**△△7.59±1.39*△12 h 5.91±0.79 10.10±0.52**7.27±0.92**△△7.28±0.82**△△7.79±1.18**△△

3 討 論

急性肺損傷是SAP早期并發(fā)癥之一，SAP相關(guān)肺損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為急性炎癥在SAP及其相關(guān)肺損傷形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］，同時(shí)也有學(xué)者認(rèn)為凝血功能紊亂與胰腺微循環(huán)障礙和全身炎癥反應(yīng)綜合征有密切關(guān)系［11］。FGL2凝血酶原酶屬于纖維蛋白原家族，是一種促凝因子，在微血栓形成中起著關(guān)鍵作用，與細(xì)胞凋亡、血管生成和炎癥反應(yīng)有關(guān)［12-14］，是聯(lián)系炎癥和凝血的關(guān)鍵蛋白。有研究證明FGL2凝血酶原酶可能通過(guò)介導(dǎo)胰腺內(nèi)微血栓的形成而促進(jìn)SAP的發(fā)生與發(fā)展［3］，SAP大鼠肝組織中FGL2凝血酶原酶基因和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，F(xiàn)GL2凝血酶原酶的表達(dá)升高與肝細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度及病理分級(jí)呈正相關(guān)［4］，腺病毒介導(dǎo)的人工小RNA靶向FGL2，在牛磺膽酸誘導(dǎo)的小鼠胰腺炎模型中顯著抑制了FGL2的表達(dá)，改善了SAP早期的凋亡，改善了炎癥，從而起到保護(hù)作用，減輕了胰腺損傷［5］。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)胰膽管逆行注入?；悄懰徕c建立大鼠SAP肺損傷模型，發(fā)現(xiàn)肺組織中FGL2 mRNA和蛋白的表達(dá)較假手術(shù)組顯著增加，同時(shí)3個(gè)時(shí)相點(diǎn)大鼠肺組織TNF-α分泌水平較假手術(shù)組明顯增高、TXB2水平及TXB2/6-Keto-PGF1α比值較假手術(shù)組同一時(shí)相點(diǎn)明顯增高，提示FGL2凝血酶原酶可能通過(guò)介導(dǎo)肺組織微循環(huán)障礙而促進(jìn)SAP肺損傷炎癥的發(fā)生與發(fā)展。

根據(jù)SAP多表現(xiàn)為腹痛、嘔吐、便結(jié)、黃疸等癥狀，屬于中醫(yī)“厥脫”“陽(yáng)明腑實(shí)證”等范疇，中醫(yī)認(rèn)為SAP是由于肝膽失疏、溫?zé)崽N(yùn)結(jié)，或上迫于肺，或內(nèi)陷心包，或熱傷血絡(luò)，因此，中醫(yī)將通里攻下、活血化瘀、清熱解毒作為治療該癥的基本治則。大黃具有蕩滌腸胃、攻下瀉火、清熱解毒、活血化瘀等功效，對(duì)SAP有積極治療的作用，是臨床上治療AP的要藥［15］。大黃素是大黃的主要有效單體之一，項(xiàng)目組前期的研究也發(fā)現(xiàn)，大黃素能明顯降低SAP肺損傷大鼠血清淀粉酶活性，改善胰腺、肺組織炎癥和組織結(jié)構(gòu)損傷［8，16］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，大黃素可明顯下調(diào)SAP肺損傷大鼠肺組織中FGL2、TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)，同時(shí)還可降低TXB2水平及TXB2/6-Keto-PGF1α比值，提示大黃素可能通過(guò)下調(diào)FGL2凝血酶原酶和TNF-α的表達(dá)，減少血栓素合成及釋放，從而抑制肺組織的過(guò)度炎癥反應(yīng)，防止血小板聚集和血栓形成，這是其抗SAP肺損傷的重要作用機(jī)制。