潘福璐 韓星 冀艷華 江曉泉 森慕黎 劉洋 林瑞超

摘要?目的：基于多成分序貫代謝的研究策略，探討枸杞子在體內(nèi)的代謝成分，遴選枸杞子的質(zhì)控成分。方法：制備枸杞子水提液后，運用在體雙向腸灌流技術(shù)和灌胃采血技術(shù)收集其腸代謝、肝代謝及綜合代謝樣品，結(jié)合超高效液相色譜-四級桿/靜電場高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-Exactive MS），對枸杞子水提物、腸代謝樣品、肝代謝樣品及綜合代謝樣品中的成分進行鑒別，遴選枸杞子的質(zhì)控成分。結(jié)果：枸杞子提取物經(jīng)LC-MS分析，共鑒定出36個化學(xué)成分。序貫代謝研究表明，枸杞子中有20個原形入血成分，其中有17個成分在經(jīng)過腸代謝后可以檢測到，16個成分在經(jīng)過肝代謝后可以檢測到，11個成分經(jīng)過灌胃給藥后，在腹主動脈血中可以檢測到。結(jié)論：根據(jù)序貫代謝的研究結(jié)果，可以將這11個成分作為枸杞子藥材的候選指標(biāo)性成分，其分別為咖啡酸己糖偶聯(lián)物、香豆酸己糖偶聯(lián)物、N-caffeoyl，N′-dihydrocaffeoyl spermidine dihexose、綠原酸、N1，N10-bis（dihydrocaffeoyl）spermidine hexose、香豆素、槲皮素-O-蕓香糖苷、阿魏酸、蘆丁、N-乙酰色氨酸、水楊酸。

關(guān)鍵詞?枸杞子;序貫代謝;多成分藥物代謝;質(zhì)控成分;質(zhì)量控制

Abstract?Objective：In order to select the quality control components，and explore the metabolic components of Fructus Lycii in vivo，based on the research strategy of multicomponent sequential metabolism.Methods：After preparing the water extract of Fructus Lycii，in-vivo two-way intestinal perfusion technology and intragastric blood collection technology were used to collect its intestinal metabolism，liver metabolism and comprehensive metabolism samples，combined with ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field high-resolution mass spectrometry Technology（UPLC-Q-Exactive MS），to identify the ingredients in the water extract of wolfberry，intestinal metabolism samples，liver metabolism samples and comprehensive metabolism samples，and select the quality control components of Fructus Lycii.Results：A total of 36 chemical components were identified by LC-MS analysis of Fructus Lycii extract.Sequential metabolic studies have shown that there were 20 protoplasmic components in Fructus Lycii，of which 17 components could be detected after intestinal metabolism，16 components could be detected after intestinal metabolism followed by liver metabolism，and 11 components could be detected in comprehensive metabolic samples after intragastric administration.Conclusion：According to the results of sequential metabolism，these 11 elements can be used as quality control components of Fructus Lycii，including caffeic acid hexose conjugate，coumaric acid hexose conjugate，N-caffeoyl，N′-dihydrocaffeoyl spermidine dihexose，chlorogenic acid，N1，N10-bis（dihydrocaffeoyl）spermidine hexose，coumarin，quercetin 3-O-rutinoside，ferulic acid，rutin，N-acetyltryptophan，andsalicylic acid.

Keywords?Fructus Lycii; Sequential metabolism; Multicomponent drug metabolism; Quality control ingredients; Quality control

中圖分類號：R284.1文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.004

枸杞子是一味名貴的藥食同源中藥材，其為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實，具有滋腎，潤肺，補肝，明目等功效[1]?，F(xiàn)代植物化學(xué)分析表明，枸杞中主要含有多糖、黃酮、氨基酸、多酚和生物堿等化合物[2]。2015年版《中華人民共和國藥典》中將枸杞多糖（以葡萄糖計）和甜菜堿作為含量測定項下的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。雖然枸杞多糖和甜菜堿的藥理活性已被大量文獻報道和證實[3]，但這不足以反映枸杞子多成分多功效的特性和全面評價枸杞子藥材的品質(zhì)。多成分藥物發(fā)揮藥效是多種成分面對多個靶點的綜合作用[4]，這些成分到達靶點的代謝過程決定了它們產(chǎn)生療效的可能性，因此天然多成分藥物的多種成分代謝動態(tài)過程研究已經(jīng)發(fā)展成為一個熱點科研方向?；诖?，本研究運用課題組前期開發(fā)的序貫代謝的研究策略[5]，系統(tǒng)描繪了枸杞子提取物口服給藥后多成分動態(tài)吸收和代謝的變化輪廓，并獲得其血中移行成分，為其質(zhì)控成分的遴選和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?SD雄性大鼠，SPF級，體質(zhì)量約（200～250）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可合格證號：SCXF（京）2016-0002，并已通過北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理部的倫理審批（倫理審批號：BUCM-4-2019060515-1028）。實驗前將大鼠置于晝夜節(jié)律光照條件下，自由進食進水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.1.2?藥物?枸杞子藥材由寧夏百瑞源枸杞股份有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王晶娟副教授鑒定為寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實。綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201817），咖啡酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110885-201703），蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201811），甜菜堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110894-201604），原兒茶醛對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110810-201608），兒茶素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110877-201604），阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201614），表兒茶素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110878-201703）。

1.1.3?試劑與儀器?固相萃取柱（美國Waters公司，型號：OASIS PRIME HLB Cartridge），娃哈哈純凈水，甲醇、乙腈為色譜級，其余試劑均為分析純超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（賽默飛世爾科技，美國，型號：UltiMate 3000-Q-Orbitrap），包括UltiMate 3000超高效液相色譜儀、Q-Exactive四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、DAD檢測器、Xcalibur質(zhì)譜工作站;電子分析天平（Sartorius公司，德國，型號：BSA2202S）;電子分析天平（Sartorius公司，德國，型號：BSA124S）;超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ5200E）;電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司，型號：HH-2A）;高速離心機（北京白洋醫(yī)療器械有限公司，型號：BY-400C）;水浴氮吹儀（北京成萌偉業(yè)科技有限公司，型號：CM-12）;蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司，型號：BT-100-1F）。

1.2?方法

1.2.1?分組?將大鼠分為腸代謝手術(shù)組、肝代謝手術(shù)組與綜合代謝手術(shù)組。

1.2.2?給藥方法?1）枸杞子水提液制備：稱取枸杞子藥材1.02 g，加入100 mL蒸餾水回流1 h，過0.22 μm濾膜過濾，棄去初濾液，即得。2）腸代謝手術(shù)組：取4只禁食12 h大鼠（不禁水），腹腔麻醉，腹主動脈采血置于預(yù)先涂抹肝素鈉的離心管中。收集的血液置于37 ℃水浴中，用于補充手術(shù)鼠實驗過程中損失的血液。另取一只同樣禁食大鼠腹腔麻醉，小心剖離頸靜脈，插管。管的另一端通過蠕動泵連接到剛剛?cè)〕龅难褐小Ｑ馗怪芯€剪開腹腔，選取空腸段約10 cm作為供試腸段，結(jié)扎實驗用腸段以外的血管。37 ℃生理鹽水緩慢沖出腸內(nèi)容物，至流出液澄清，繼續(xù)充入空氣將生理鹽水排凈。注射泵與腸段進口端相連，灌流（0.2 mL/min）一定量枸杞子水提液（1 g/mL）。用37 ℃生理鹽水潤濕的紗布覆蓋在裸露腸段上，保溫?zé)艏訜帷＝Y(jié)扎肝門靜脈及旁支有干擾的細血管，同時開啟蠕動泵，進行頸靜脈輸血（流速0.3 mL/min），腸系膜靜脈采血。連續(xù)采血2 h，平行操作3組。空白組給藥生理鹽水，其余操作相同。3）肝代謝手術(shù)組：不結(jié)扎肝門靜脈，在股靜脈處采血，其余操作同“腸代謝手術(shù)組”。4）綜合代謝手術(shù)組：選取12只SD大鼠，將大鼠隨機分為四組，每3只為1組，灌胃給與枸杞子水提液（1 g/mL），各組分別于0.5 h、1 h、1.5 h、2 h用10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉處理，于腹主動脈處采集血液樣品?？瞻捉M灌胃給與等量生理鹽水，其余操作相同。

1.2.3?檢測指標(biāo)與方法?1）對照品溶液制備：分別精密稱取上述8個對照品適量，加適量甲醇完全溶解后稀釋至濃度約為10 ng/mL，0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液即得各化合物的對照品溶液。2）血漿樣品前處理：1.5 mL血漿樣品+1.5 mL 4%磷酸，渦旋1 min，放置5 min后3 mL全部上樣固相萃取柱，接收的流出液標(biāo)為1;再用5%甲醇1 mL進行清洗，接收流出液標(biāo)為2;最后用90：10的乙腈：甲醇1 mL進行洗脫，用另一個離心管接收流出液并標(biāo)為3;在洗脫過程中盡量降低流速使其成滴流下，將洗脫液3過0.22 μm濾膜，進行LC-MS分析?？瞻籽獫{處理方法除將1.5 mL血漿樣品換成1.5 mL空白血漿外，其余操作步驟一致。3）測定條件：液相條件：色譜柱：CORTECS UPLC T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）;流速：0.3 mL/min;流動相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min，95%→95% A;1～20 min，95%→5% A;20～21 min，5%→5% A;21～21.1 min，5%→95% A;21.1～22 min，95%→95% A）;進樣體積：2 μL;檢測波長：190～400 nm（DAD檢測器）;柱溫：40 ℃;質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（HESI源）;正、負離子檢測模式;掃描范圍：100～1 500 Da;噴霧電壓：+3.5 kV（正離子模式），+3.0 kV（負離子模式）;鞘氣體積流量：35 arb;輔助氣體積流量：10 arb;輔助氣溫度：250 ℃;離子傳輸管溫度：300 ℃;掃描模式：Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS分辨率為70 000，dd-MS2分辨率為17 500;碰撞能為：20、30、40 eV。4）數(shù)據(jù)處理及代謝物鑒定：通過精確相對分子質(zhì)量及二級碎片離子信息，與對照品的保留時間、mzVault 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫、HMDB數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻報道數(shù)據(jù)比對，對枸杞子水提液及代謝樣品中的成分進行鑒定。

2?結(jié)果

2.1?枸杞子水提液中化學(xué)成分鑒定

枸杞子水提液的總離子流圖（TIC圖）。見圖1，共鑒定出36個化學(xué)成分，其中3個單糖類化合物、7個有機酸類化合物、10個生物堿類化合物、6個黃酮類化合物、2個苯丙素類化合物、2個氨基酸類化合物、1個花色苷類化合物、1個蒽醌類化合物和4個其他類化合物，結(jié)果見表1，具體分析如下：

化合物1?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 326.124 7[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C15H21NO7（Error in ppm為1.272），其二級特征碎片離子為m/z 167，通過與文獻[6]對比推測化合物1為（Dihydrocoumaroyl Glucoside）amide。

化合物2?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 251.138 7[M+H]+，軟件給出的精確分子式為C13H18N2O3（Error in ppm為-0.319），二級質(zhì)譜中存在碎片離子m/z 234[M+H-NH3]+、m/z 163[M+H-C4H12N2]+、m/z 89[M+H-C9H6O3]+，m/z 163為咖啡酰離子碎片，m/z 89為腐胺離子碎片，通過與文獻[7]對比，推測化合物2為咖啡酰腐胺。

化合物3?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 299.077 2[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C13H16O8（Error in ppm為1.056），二級質(zhì)譜中存在丟失一分子葡萄糖基的特征碎片離子m/z 137[M-H-162]-，通過與文獻[8]對比，推測該化合物為Salicylic acid-glucoside。

化合物4?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 341.087 8[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C15H18O9（Error in ppm為1.091），二級質(zhì)譜中存在碎片離子m/z 179[M-H-C6H11O5]-、m/z 179[M-H-C6H11O5-CO2]-，m/z 179為丟失己糖后產(chǎn)生的咖啡酸離子碎片，與文獻[9]給出的碎片離子相同，推測該化合物為咖啡酸己糖偶聯(lián)物。

化合物5?保留時間為4.00 min，一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 137.023 2[M-H]-，通過與原兒茶醛對照品保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比，確定該化合物為原兒茶醛。

化合物6?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 693.369 6[M+H]+，二級碎片離子有m/z 455、m/z 384、m/z 293、m/z 222，與文獻[10]給出的碎片離子相同，推測該化合物為tris（Dihydrocaffeoyl）Spermine。

化合物7?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 325.092 9[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C15H18O8（Error in ppm為1.106），二級碎片離子有m/z 163[M-H-162]-、m/z 145[M-H-162-H2O]-，與文獻[7]給出的碎片離子相同，推測該化合物為草木樨苷。

化合物8?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 531.317 4[M+H]+，軟件給出的精確分子式為C28H43N4O6（Error in ppm為-0.571），二級碎片離子有m/z 293、m/z 222、m/z 165，與文獻[10]報道的碎片離子相同，推測該化合物為N1，N14-bis-（dihydrocaffeoyl）Spermine（Kukoamine A）。

化合物9?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 343.103 5[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C15H20O9（Error in ppm為1.141），二級碎片離子有m/z 181[M-H-162]-、m/z 137[M-H-162-CO2]-，通過與文獻[6]比較推測該化合物為Homovanillic acid hexose。

化合物10?保留時間為4.54 min，一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 289.071 4[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C15H14O6（Error in ppm為0.735），通過與兒茶素對照品保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比，確定該化合物為兒茶素。

化合物11?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 796.348 2[M+H]+，軟件給出的精確分子式為C37H53N3O16（Error in ppm為-1.659），二級碎片離子有丟失一分子糖基和丟失兩分子糖基的碎片離子m/z 634[M+H-162]+、m/z 472[M+H-162-162]+，與文獻[10]報道的碎片離子相同，推測該化合物為N-caffeoyl，N′-dihydrocaffeoyl spermidine dihexose。

化合物12?保留時間為4.78 min，一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 353.087 8[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C16H18O9（Error in ppm為1.091），通過與綠原酸對照品保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比，確定該化合物為綠原酸。

化合物13?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 353.102 0[M+H]+，軟件給出的精確分子式為C16H18O9（Error in ppm為-0.359），二級特征碎片離子為m/z 163，為咖啡酰碎片離子。通過與mzVault 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行比較，發(fā)現(xiàn)裂解規(guī)律相同，故確定該化合物為1-咖啡?？鼘幩帷?/p>

化合物14?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 325.092 9[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C15H18O8（Error in ppm為1.106），二級質(zhì)譜中存在碎片離子m/z 163[M-H-162]-、m/z 119[M-H-162-CO2]-，m/z 163為丟失糖基后產(chǎn)生的香豆酸碎片離子，根據(jù)文獻[9]推測該化合物為香豆酸己糖偶聯(lián)物。

化合物15?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 636.312 1[M+H]+，二級特征碎片離子有m/z 474[M+H-162]+和m/z 222[M+H-162-dihydrocaffeoyl-C4H12N2]+，與文獻[10]報道的相同，推測該化合物為N1，N10-bis（dihydrocaffeoyl）spermidine hexose。

化合物16?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 634.298 7[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C31H45N3O11（Error in ppm為2.624），二級碎片離子有m/z 427、m/z 350、m/z 308，其裂解規(guī)律和文獻報道[11]相同，推測該化合物為N，N-bis-dhc-spermidine-Hex。

化合物17?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 771.198 7[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C33H40O21（Error in ppm為1.084），二級碎片離子有丟失一分子糖基的m/z 609[M-H-162]-，根據(jù)文獻[11]推測該化合物為quercetin-O-Rut-Hex。

化合物18?保留時間為5.505 min，一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 179.034 1[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C9H8O4（Error in ppm為1.200），通過與咖啡酸對照品保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比，確定該化合物為咖啡酸。

化合物19?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 632.282 7[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C31H43N3O11（Error in ppm為2.079），二級碎片離子有m/z 470[M-H-162]-，結(jié)合文獻報道[11]，推測該化合物為dhc-caffeoyl-spermidine-Hex。

化合物20?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 474.259 4[M+H]+，軟件給出的精確分子式為C25H36N3O6（Error in ppm為-1.565），二級碎片離子有m/z 236、m/z 222、m/z 165、m/z 123，結(jié)合文獻報道[10]，推測該化合物為N1，N10-bis-（dihydrocaffeoyl）spermidine。

化合物21?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 472.245 5[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C25H35N3O6（Error in ppm為2.240），二級特征碎片離子有m/z 308，是二氫咖啡酰的碎片離子，與文獻[6]報道相同，推測該化合物為bis（dihydrocaffeoyl）spermidine。

化合物22?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 470.229 8[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C25H33N3O6（Error in ppm為2.240），二級碎片離子m/z 308為二氫咖啡酰的碎片離子，結(jié)合文獻報道[11]，推測該化合物為dhc-caffeoyl spermidine isomer。

化合物23?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 355.103 5[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C16H20O9（Error in ppm為3.214），二級質(zhì)譜中存在特征碎片離子m/z 193[M-H-162]-，m/z 175[M-H-162-H2O]-，與文獻[7]報道相同，推測化合物23為阿魏酸-O-葡萄糖苷。

化合物24?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 470.228 1[M+H]+，軟件給出的精確分子式為C25H32N3O6（Error in ppm為-1.004），二級質(zhì)譜中存在碎片離子m/z 308[M+H-162]+、m/z 291[M+H-162-NH3]+、m/z 291[M+H-162-NH3-71]+，同時存在咖啡酰碎片離子峰m/z 163，與文獻[7]報道相同，推測該化合物為N1，N10-二咖啡酰亞精胺。

化合物25?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 147.043 8[M+H]+，軟件給出的精確分子式為C9H6O2（Error in ppm為-1.673），其二級特征碎片離子為m/z 119，為分子離子丟失一分子羰基所得，與文獻[7]報道相同，推測化合物為香豆素。

化合物26?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 163.039 2[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C9H8O3（Error in ppm為1.530），其二級特征碎片離子為m/z 119，為分子離子丟失一分子羰基所得，與文獻[7]報道相同，推測該化合物為對香豆酸。

化合物27?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 609.146 3[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C27H30O16（Error in ppm為2.116），二級碎片離子有m/z 301[M-H-308]-，m/z 271和m/z 255是槲皮素的特征碎片，與文獻[11]報道相同，推測化合物27為槲皮素-O-蕓香糖苷。

化合物28?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 303.049 6[M+H]+，軟件給出的精確分子式為C15H10O7（Error in ppm為-2.010），與mzVault 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中的槲皮素的裂解規(guī)律相同，推測化合物28為槲皮素。

化合物29?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 465.102 6[M+H]+，軟件給出的精確分子式為C21H20O12（Error in ppm為-0.328），與mzVault 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中的金絲桃苷的裂解過程相同，推測化合物29為金絲桃苷。

化合物30?保留時間為6.59 min，一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 195.065 1[M+H]+，軟件給出的精確分子式為C10H10O4（Error in ppm為-0.437），特征二級碎片離子有m/z 177[M+H-H2O]+，m/z 145[M+H-H2O-CO]+，通過與阿魏酸對照品保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比，確定該化合物為阿魏酸。

化合物31?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 609.145 9[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C27H30O16（Error in ppm為1.459），有二級碎片離子m/z 300、m/z 271、m/z 178、m/z 151，通過與蘆丁對照品保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比，確定該化合物為蘆丁。

化合物32?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 245.093 0[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C13H14N2O3（Error in ppm為3.799），二級質(zhì)譜中的碎片離子有m/z 203[M-H-CH2CO]-，m/z 116、m/z 98、m/z 74，與文獻[7]報道相同，推測該化合物為N-乙酰色氨酸。

化合物33?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 203.082 6[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C11H11N2O2（Error in ppm為5.544），二級質(zhì)譜中的碎片離子有m/z 186[M-H-NH3]-、m/z 159[M-H-CO2]-、m/z 142[M-H-CO-NH3]-和m/z 116[M-H-CO-NH3-C2H2]-，與文獻[7]報道相同，推測該化合物為色氨酸。

化合物34?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 593.165 2[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C27H30O15（Error in ppm為2.366），二級特征碎片離子為丟失一分子蕓香糖苷后的碎片離子m/z 285[M-H-308]-，與文獻[7]報道相同，推測該化合物為山柰酚蕓香苷。

化合物35?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 623.162 3[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C28H32O16（Error in ppm為2.630），二級特征碎片離子有丟失一分子蕓香糖苷的碎片離子m/z 315[M-H-308]-，與文獻[7]報道相同，推測該化合物為矮牽牛素-3-O-蕓香苷。

化合物36?一級質(zhì)譜分子離子峰為m/z 137.023 3[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C7H6O8（Error in ppm為-0.153），二級碎片離子存在m/z 93[M-H-CO2]-，與文獻[7]報道相同，推測該化合物為水楊酸。

2.2?枸杞子代謝成分鑒定

通過經(jīng)過對各血漿樣品進行LC-MS分析，并與水提物進行對比發(fā)現(xiàn)各部位的原形入血成分，結(jié)果見表2?？Х人峒禾桥悸?lián)物、香豆酸己糖偶聯(lián)物、N-caffeoyl，N′-dihydrocaffeoyl spermidine dihexose、綠原酸、N1，N10-bis（dihydrocaffeoyl）spermidine hexose、槲皮素-O-蕓香糖苷、阿魏酸、蘆丁、N-乙酰色氨酸、水楊酸存在于所有的血液樣本中;兒茶素、N，N-bis-dhc-spermidine-Hex、dhc-caffeoyl-spermidine-Hex和N1，N10-bis-（dihydrocaffeoyl）spermidine經(jīng)過腸道吸收后可以檢測到，但經(jīng)過肝臟后卻消失了，說明這些化合物主要被肝臟代謝清除了。山柰酚蕓香苷、quercetin-O-Rut-Hex和矮牽牛素-3-O-蕓香苷經(jīng)過腸道后未檢測到，后經(jīng)過肝臟又重新出現(xiàn)，其在綜合代謝的血液樣本中也未檢測到，說明其經(jīng)過腸道被代謝，后經(jīng)過肝代謝重新生成。另外這3個化合物存在被胃液降解或腸道菌群代謝的可能。Homovanillic Acid Hexose在灌流的血液樣本中可以檢測到，但是經(jīng)綜合代謝的血液樣本未檢測到，推測其灌胃給藥后，有可能被胃液降解或腸道菌群代謝。將表2中的原形入血成分作為枸杞子質(zhì)量控制成分。

3?討論

本研究采用在體雙向腸灌流技術(shù)和灌胃采血技術(shù)相結(jié)合的方法，有以下優(yōu)點：1）該技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)血中與藥效相關(guān)的潛在活性原形成分，并可溯源至藥材中對應(yīng)的化學(xué)成分;2）該技術(shù)可以闡明原形成分和代謝成分在不同部位的代謝動態(tài)轉(zhuǎn)移;3）該技術(shù)通過應(yīng)用高靈敏度檢測器、大量供血循環(huán)灌流和SPE血漿制備方法三維組合，可以更大程度避免漏檢體內(nèi)入血成分的情況。

由研究結(jié)果可知，枸杞子提取物經(jīng)LC-MS分析，共鑒定出36個化學(xué)成分。序貫代謝研究表明，枸杞子中有20個原形入血成分，其中有17個成分在經(jīng)過腸代謝后可以檢測到，16個成分在經(jīng)過肝代謝后可以檢測到，11個成分經(jīng)過灌胃給藥后，在腹主動脈血中可以檢測到。其中綜合代謝的11個成分在肝代謝的血液樣本中均可以檢測到。中藥中的原形入血成分和代謝成分均能發(fā)揮藥效作用，但是在本研究中未考慮代謝成分的藥效作用，原因有以下幾點：1）一個化學(xué)成分會有多種代謝產(chǎn)物，有的則高達50種甚至100種以上的代謝產(chǎn)物，任務(wù)量大;2）有研究表明[12]，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定后確認的原形成分占所有血中移行成分的28%，而代謝產(chǎn)物僅占所有血中移行成分的3.8%，因此暫不考慮代謝成分的活性，可以將這11個成分作為枸杞子藥材的候選指標(biāo)性成分。綜上所述，該研究可以為枸杞子品質(zhì)評價標(biāo)準(zhǔn)的制定提供合理的依據(jù)，也可以為枸杞子藥效和藥理作用機制研究以及相應(yīng)藥品和食品的研發(fā)提供參考。

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（2020-06-10收稿?責(zé)任編輯：徐穎）