李軍山 李雪利 高杰 高晗 張肖建 孫福仁

摘要? 目的：對(duì)蛇床子飲片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備，并研究其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：按照中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求中的相關(guān)規(guī)定，對(duì)15批產(chǎn)自不同地區(qū)的蛇床子飲片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備，對(duì)其主含成分蛇床子素進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算15批標(biāo)湯的出膏率及蛇床子素的含量轉(zhuǎn)移率，并對(duì)高效液相色譜法（HPLC）特征圖譜進(jìn)行方法建立。結(jié)果：蛇床子素轉(zhuǎn)移率為3.35% ～6.09%，出膏率為14.10% ～19.93%。對(duì)特征譜圖中的8個(gè)特征峰中的5個(gè)色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)。結(jié)論：蛇床子飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑符合中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求中的相關(guān)規(guī)定，測(cè)定方法精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，可以為蛇床子配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞? 蛇床子;蛇床子素;標(biāo)準(zhǔn)湯劑;轉(zhuǎn)移率;出膏率;含量測(cè)定;特征圖譜;中藥化學(xué)

Study on Quality Standard of Standard Decoction of Based on Shechuangzi Formula Granules

LI Junshan1，2，LI Xueli1，GAO Jie1，GAO Han1，ZHANG Xiaoian1，SUN Furen1

（1 Shineway Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Shijiazhuang 051430，China; 2 TCM Formula Granule Engineering Technology Research Center of Hebei，Shijiazhuang 050091，China）

Abstract Objective： To prepare the standard Shechuangzi Decoction Pieces and study its quality standard. Methods： According to the relevant provisions of the technical requirements for the quality control and standard formulation of Chinese medicine formula granules，a total of 15 batches of Shechuangzi Decoction Pieces from different origins were prepared for standard decoction.The content of osthole in its main component was determined，the cream extraction rate and the content transfer rate of osthole in 15 batches of standard decoction were calculated，and the HPLC characteristic map method was developed. Results： By analyzing the determination results of 15 batches of standard decoction of Shechuangzi Decoction Pieces，the transfer rate of osthole ranged from 3.35% to 6.09%.The extraction rate was 14.10%-19.93%.A HPLC characteristic atlas analysis was established，and 5 chromatographic peaks were identified from 8 characteristic peaks in characteristic atlas. Conclusion： The standard decoction of Shechuang zi Decoction Pieces meets the relevant regulations in the technical requirements for quality control and standard formulation of Chinese medicine formula granules.The determination method has good precision，stability and repeatability，and can provide reference for the quality control of the Shechuangzi Formula Granules

Keywords? Fructus Cnidii; Osthole; Standard decoction; Transfer rate; Extraction rate; Determination of content; Characteristic chromatograms; Chemistry of Chinese medicine

中圖分類號(hào)：R283 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.005

蛇床子為傘形科植物蛇床 Cnidium monnieri （L.）Cuss.的干燥成熟果實(shí)，又名蛇米（《本經(jīng)》）、蛇珠（《吳普本草》）、蛇床仁（《藥性論》）、野茴香（江西《草藥手冊(cè)》）等。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[1-2]，李時(shí)珍謂：“蛇虺喜臥子下食其子，故有蛇床、蛇粟諸名”。香豆素類成分為蛇床子的主要藥效成分，其中蛇床子素含量最高，約占總香豆素的60%，其他香豆素類成分有水合橙皮內(nèi)酯、花椒毒素、花椒毒酚、歐芹屬素乙、佛手柑內(nèi)酯、白芷素等。用于陰癢帶下，濕疹瘙癢，濕痹腰痛，腎虛陽痿，宮冷不孕。用量3～10 g，外用適量，多煎湯熏洗，或研末調(diào)敷[3-5]。研究表明，蛇床子對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均具有好的作用，常用于治療外科、婦科、皮膚等方面的疾病[6]。

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑可以標(biāo)化不同的臨床用藥形式，提高臨床用藥的準(zhǔn)確性和劑量的一致性[7]。配方顆粒的生產(chǎn)工藝參數(shù)、質(zhì)量控制方法和有效指標(biāo)成分的選擇等方面研究均須匹配標(biāo)準(zhǔn)湯劑等的相關(guān)研究。本研究按照標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法，以采收自15個(gè)不同產(chǎn)地的蛇床子飲片為原料制備標(biāo)湯，對(duì)蛇床子素進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算蛇床子轉(zhuǎn)移率和標(biāo)湯出膏率范圍，并建立特征圖譜方法，為提高蛇床子配方顆粒的質(zhì)量控制水平和規(guī)范其臨床用藥提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司，型號(hào)：CPA225D）;電子天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：JM-A5002）;水循環(huán)真空泵（上海申生科技有限公司）;熱風(fēng)循環(huán)鼓風(fēng)干燥箱（太倉(cāng)精宏儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：DHG-9140A）;高效液相色譜儀（日本島津公司，日本，型號(hào)：LC-20AT）;超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，型號(hào)：KH3200E）。

1.2 試劑 蛇床子素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)：110822-201710）;歐前胡素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)：110826-201616）;對(duì)香豆酸（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：17082310）;花椒毒素（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：HA061509198）;花椒毒酚（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：HX106886198）甲醇（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20180820）;乙腈（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純）;甲醇（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純）;水（實(shí)驗(yàn)室自制，去離子水）。

1.3 分析樣品 15批不同產(chǎn)地蛇床子藥材，經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)研究院孫寶惠鑒定為正品，樣品來源信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動(dòng)相組成A（水）﹕B（乙腈）為35∶ 65;檢測(cè)波長(zhǎng)為322 nm。理論板數(shù)按蛇床子素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取蛇床子素對(duì)照品10 mg，精密稱定，加乙醇適量制成每l mL含20 μg的溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品研細(xì)，稱取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無水乙醇25 mL，密塞，稱重，超聲處理30 min，放冷，再次稱重，補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得[14-15]。

2.1.4 專屬性試驗(yàn) 取空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液，分別采用2.1.1色譜條件，進(jìn)行HPLC色譜測(cè)定。樣品與對(duì)照品在同一保留時(shí)間有相同的波峰出現(xiàn)，而空白溶液則無相應(yīng)的峰，證明含量測(cè)定專屬性良好。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，進(jìn)樣分析，記錄蛇床子素峰面積，并以蛇床子素峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)樣蛇床子素的量為橫坐標(biāo)X，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程Y=873 21X+462 7.5，r=0.999 9，結(jié)果表明蛇床子素在0.026 4～0.527 6 μg，范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.999 9線性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取蛇床子標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品（標(biāo)1）按“2.2.3”所規(guī)定方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，測(cè)定峰面積（蛇床子素）的RSD值為0.31%，說明設(shè)備具有良好的精密度。

2.1.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一個(gè)供試品溶液，分別于0，3，6，9，12，15 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定蛇床子素含量，計(jì)算各樣品中峰面積（蛇床子素）的RSD值為0.53%，說明15 h內(nèi)此樣品溶液穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取蛇床子標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品（標(biāo)1）供試品6份，每份約0.1 g，精密稱定。按“2.2.3”所規(guī)定方法處理標(biāo)湯劑樣品，按“2.2.1色譜條件”進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算供試品中蛇床子素含量，6份供試品中蛇床子素含量的RSD為0.81%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 回收率試驗(yàn) 取蛇床子標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品（標(biāo)1）供試品9份，每份約0.05 g精密稱定，按每3份為一組，每組精密加入蛇床子素對(duì)照品相當(dāng)于蛇床子標(biāo)準(zhǔn)湯劑所含蛇床子素量的80%，100%，120%，置具塞錐形瓶中，按2.2.1色譜條件項(xiàng)下進(jìn)樣10 μL測(cè)定，蛇床子素平均加樣回收率為100.80%，加樣回收率RSD為1.51%。見表2。

2.1.10 樣品測(cè)定結(jié)果 按“稱取蛇床子飲片200 g，以水為提取溶媒，提取2次[8]。第一煎加水1 600 mL，先泡30 min，然后開始加熱，煮沸后計(jì)時(shí)30 min;第二煎加水1 200 mL，煮沸后計(jì)時(shí)20 min。合并2次煎液，用300目的篩網(wǎng)趁熱過濾。濾液迅速冷卻，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器低溫（60 ℃，-0.085 MPa）濃縮至適當(dāng)相對(duì)密度的流浸膏，放置在玻璃蒸發(fā)皿中冷凍干燥，制成標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末”[9-13]。所述方法制備15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率即為標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末（m2）與蛇床子飲片（m1）：

出膏率= m2 m1

按“蛇床子及標(biāo)準(zhǔn)湯劑中蛇床子素含量的測(cè)定方法”測(cè)定蛇床子飲片、蛇床子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量[14-15]：

含量轉(zhuǎn)移率= 標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量×出膏率 飲片含量 ×100%

15批蛇床子標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率在14.10% ～19.93%，出膏率平均值為15.84%，SD值為1.71;標(biāo)準(zhǔn)湯劑中蛇床子素含量范圍為3.26～5.85 mg/g，含量平均值為4.63 mg/g，SD值為0.74;蛇床子素含量轉(zhuǎn)移率范圍為3.35% ～6.09%，轉(zhuǎn)移率均值為4.72%，SD值為0.96。

2.2 特征圖譜測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent公司ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.1%冰醋酸溶液[16]，按下表比例進(jìn)行梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)為310 nm;流速1 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取蛇床子素、花椒毒素、花椒毒酚、歐前胡素和對(duì)香豆酸對(duì)照品適量，精密稱定，加乙醇制成每l mL含蛇床子素30 μg、花椒毒素20 μg、花椒毒酚20 μg、歐前胡素10 μg、對(duì)香豆酸20 μg的混合溶液[17-18]，即得。見圖1。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品0.2 g，精密稱定，置磨口三角瓶中，精密量取70%乙醇25 mL，加入三角瓶中，稱重，密塞，超聲處理20 min，放冷，再次稱重，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得[19]。見圖2。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取蛇床子標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品（標(biāo)1），按“2.2.3”所述方法處理樣品，重復(fù)進(jìn)樣6次，以蛇床子素為S峰，計(jì)算其他主要色譜峰的RRT及RPA，結(jié)果顯示各峰RRT的RSD<0.9%，RPA的RSD<2.9%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批標(biāo)湯制備的樣品溶液，按“2.2.1色譜條件”規(guī)定，分別在0，3，6，9，12，15，18 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以蛇床子素為S峰，計(jì)算其他主要色譜峰的RRT及RPA，結(jié)果顯示各峰RRT的RSD<0.6%，RPA的RSD<2.7%，表明在18 h內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取蛇床子標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品（標(biāo)1），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，制備平行樣品6份，按2.2.1所述條件，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以蛇床子素為S峰，計(jì)算其他主要色譜峰的RRT及RPA，結(jié)果顯示各峰RRT的RSD<1.1%，RPA的RSD<3.0%。

2.2.7 樣品測(cè)定結(jié)果 取15批蛇床子標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按2.2.1色譜條件測(cè)定HPLC圖譜。測(cè)定完后把15批HPLC圖譜導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件中進(jìn)行分析。見圖3。15批蛇床子標(biāo)準(zhǔn)湯劑共呈現(xiàn)8個(gè)共有特征峰，以8號(hào)峰蛇床子素為參照峰，計(jì)算8個(gè)共有色譜峰的RRT及RPA。見表5、表6。

結(jié)果表明，15批蛇床子標(biāo)準(zhǔn)湯劑各特征峰的RRT均在規(guī)定值：峰1（0.20）、峰2（0.29）、峰3（0.33）、峰4（0.35）、峰5（0.58）、峰6（0.61）、峰7（0.96）、峰8（1.00）±5%范圍內(nèi)。

3 討論

3.1 提取溶劑考察 蛇床子配方標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜樣品制備方法考察了純化水、無水乙醇、100%甲醇、70%甲醇、20%甲醇、70%乙醇、20%乙醇共7種提取溶劑，以色譜峰個(gè)數(shù)、基線穩(wěn)定性等為考察指標(biāo)，最終確定用70%乙醇進(jìn)行樣品溶液制備。

3.2 流動(dòng)相選擇 特征圖譜在條件摸索階段有機(jī)相考察了流動(dòng)相：甲醇[20]、乙腈，水相考察了0.1%磷酸，0.1%冰醋酸及水，通過對(duì)比色譜圖發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為乙腈-0.1%冰醋酸時(shí)，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰分離良好，因此選用乙腈-0.1%冰醋酸作為流動(dòng)相。

3.3 色譜柱及柱溫 考察了ZORBAX Eclipse Plus C18及InertSustain AQ-C18，柱溫25 ℃、30 ℃、35 ℃，結(jié)果顯示ZORBAX Eclipse Plus C18，柱溫30 ℃時(shí)效果最優(yōu)。

3.4 提取用純化水、飲用水考察 先后考察了純化水、飲用水提取的差異，飲用水提取出膏率為15.30%，蛇床子素含量為3.17 mg/g，含量轉(zhuǎn)移率為4.58%;純化水提取出膏率為14.98%，蛇床子素含量為3.59 mg/g，含量轉(zhuǎn)移率為5.07%，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出提取效果受加水量多少影響較小。

3.5 煎煮時(shí)間考察 考察了一煎20/二煎20 min、一煎30/二煎20 min、一煎40/二煎30 min及一煎60/二煎40 min，結(jié)果出膏率為14.76%、15.31%、15.52%、15.50%，蛇床子含量轉(zhuǎn)移率為3.21%、3.98%、3.63%、3.70%，標(biāo)湯中蛇床子素含量轉(zhuǎn)移率和出膏率呈先上升后趨于平穩(wěn)的狀態(tài)。

3.6 加水量考察 考察了8/6倍、10/8倍、11/9倍、15/13倍及20/18倍加水量對(duì)提取效果影響，結(jié)果出膏率為15.30%、16.41%、17.14%、18.31%、19.09%，蛇床子素含量轉(zhuǎn)移率為4.58%、4.79%、6.52%、8.47%、10.06%，標(biāo)湯中出膏率隨加水量增加有提升，蛇床子含量轉(zhuǎn)移率亦有上升趨勢(shì)，所以標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法應(yīng)該統(tǒng)一。

我們根據(jù)中藥配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)制定相關(guān)要求，制備了15批蛇床子標(biāo)準(zhǔn)湯劑，并對(duì)標(biāo)湯出膏率及蛇床子素轉(zhuǎn)移率進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)確定了特征圖譜測(cè)定方法及評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立了蛇床子標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為確定蛇床子配方顆粒生產(chǎn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：263.

[2]徐國(guó)鈞.中國(guó)藥材學(xué)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1996：1124.

[3]楊憲，楊水平，張雪.蛇床子藥材的高效液相色譜指紋圖譜[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（8）：877-881.

[4]陳艷，張國(guó)剛，余仲平.蛇床子的化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23（4）：256-260.

[5]宋麗嬌，李晉，姜艷，等.蛇床子香豆素類成分的含量測(cè)定及指紋圖譜研究[J].天津中醫(yī)藥，2016，33（6）：368-372.

[6]董欣.中藥蛇床子的研究概況[J].吉林中醫(yī)藥，2006，26（3）：58-59.

[7]陳士林，劉安，李琦，等.中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略[J].中國(guó)中藥雜志，2016，41（8）：1367-1375.

[8]劉亞倩，胡亞剛，牛曉峰.蛇床子中蛇床子素提取工藝研究[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥，2016，36（2）：879-81.

[9]朱廣偉，李西文，陳士林.白芍飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].世界中醫(yī)藥，2016，11（5）：753-757.

[10] 林偉雄，樂智勇，車海燕，等.甘草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2017，42（5）：830-835.

[11]孫寶瑩，郭濤，李西文，等.葛根飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究[J].世界中醫(yī)藥，2016，11（8）：1586-1589.

[12]張鵬，鄔蘭，李西文，等.人參飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的評(píng)價(jià)及應(yīng)用探討[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（11）：1-10.

[13]徐姣，趙嶸，代云桃，等.梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法考察[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)志，2017，23（7）：1-6.

[14]韓雪，柴金苗，李欽青，等.蛇床子搽劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房，2018，29（9）：1245-1248.

[15]徐以亮，徐海波，李松.HPLC測(cè)定獨(dú)活藥材及配方顆粒中蛇床子素的含量[J].中成藥，2005，27（1）：105-106.

[16] 連其深.蛇床子的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥材，2003，26（2）：141-144.

[17]孟繁浩，李遇伯，楊正毅，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定蛇床子中蛇床子素和歐前胡素含量[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，21（3）：201-204.

[18]張闖，田偉，王相，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定蛇床子配方顆粒中蛇床子素、花椒毒酚、花椒毒素的含量研究[J].河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2017，32（3）：34-36.

[19]翁德新，李天傲.蛇床子中5種成分的HPLC測(cè)定法[J].中國(guó)中藥雜志，2007，32（18）：1883-1885.

[20]宋麗嬌，李晉，姜艷，等.蛇床子香豆素類成分的含量測(cè)定及指紋圖譜研究[J].天津中醫(yī)藥，2016，33（6）：368.

（2019-03-19收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）

基金項(xiàng)目：河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（16272510）;河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（17272505D）

作者簡(jiǎn)介：李軍山（1965.01—），男，本科，正高級(jí)工程師，技術(shù)總監(jiān)，研究方向：從事配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及制備工藝研究，E-mail：swljs@sina.com

通信作者：李雪利（1988.04—），女，本科，工程師，工藝研究員，研究方向：從事配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及制備工藝研究，E-mail：lixuelisherly@163.com