成 琛, 史 楠, 姜霄震

(1. 中北大學 化學工程與技術學院, 山西 太原 030051;2. 中北大學 能源動力工程學院, 山西 太原 030051)

1 引 言

蛋白質(zhì)組學和基因組學的發(fā)展需要在分子水平上深入了解生物體的結(jié)構(gòu)和功能[1-3]，包括對蛋白質(zhì)等生物大分子的檢測和鑒定。然而，在其他成分濃度較高的情況下，具有重要生物學功能的低豐度蛋白質(zhì)是很難檢測到的[4]。目前常用的蛋白質(zhì)專一性檢測方法仍然是免疫檢測分析法，如酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)，依賴于抗體和抗原之間的特異性識別檢測目標分析物，即將已知的抗原或抗體包被于固相支持物上，加入酶標記抗體或抗原與吸附在固相載體上的抗原或抗體特異性結(jié)合，通過底物使酶顯色來判斷免疫發(fā)生的程度達到檢測的目的[5]。然而依賴于單克隆抗體的酶免疫檢測技術，存在抗體制備困難、生產(chǎn)成本高、穩(wěn)定性差、環(huán)境要求苛刻、使用壽命短等問題。因此，建立一個快速、簡單、特異、高通量的蛋白質(zhì)等生物大分子的檢測方法已成為分析檢測科學的研究熱點之一。分子印跡聚合物(molecular imprinted polymers, MIPs)被認為是一種很有前途的抗體替代品，MIPs與目標分子結(jié)合的過程類似于抗原和抗體的結(jié)合，與生物抗體相比，MIPs 具有穩(wěn)定性好、成本低、開發(fā)時間短、生產(chǎn)方便等優(yōu)點。

2 分子印跡技術

2.1 分子印跡發(fā)展歷程

分子印跡的概念最早是由POLYAKOV 等[6]在1931 年提出的，是“用一種新的合成方法制備的二氧化硅顆粒，具有不尋常的吸附特性”。這些“不尋常的吸附特性”已經(jīng)被許多聚合物所展示，這些聚合物被定義為MIPs[7]。20 世紀70 年代初，WULFF 等[8]和KLOTZ 等[9]引入了分子印跡的概念，他們提出以有機聚合物作為印跡模板，這為精確設計分子腔開辟了新視野。 真正的突破是在 1993 年，VLATAKIS等[10]在Nature 上發(fā)表了關于茶堿MIP 的研究報道后，分子印跡技術(molecular imprinting technique, MIT)得以廣泛關注和發(fā)展。

2.2 分子印跡基本原理

分子印跡技術基于自然界“鑰匙”和“鎖”的原理，在特定的環(huán)境(溶劑體系)中，模板分子與功能單體發(fā)生相互作用形成主客體復合物，在交聯(lián)劑的作用下功能單體交聯(lián)聚合并圍繞模板分子形成三維網(wǎng)絡空間結(jié)構(gòu)，其中模板分子通常是待識別的目標分子。隨后模板分子被洗脫，結(jié)合位點暴露，三維空間形成印跡孔穴，這些孔穴在結(jié)合作用力、官能團、空間形狀和大小上與目標分子高度互補。從本質(zhì)上說，孔穴對模板分子具有“記憶效應”，印跡孔穴可以從復雜的混合物中重新結(jié)合目標分子(如圖1 所示)。因此，MIPs 具有生物抗體的兩個最重要的特征——識別和結(jié)合特定目標分子的能力。

2.3 分子印跡特點

分子印跡技術作為一種仿生分子識別技術，具有顯著特點：(1)構(gòu)象預定性：功能單體與交聯(lián)劑在模板分子周圍聚合形成高交聯(lián)聚合物，使得官能團的取向被凍結(jié)，即使刪除模板，這個方向仍然保持不變。因此，印跡孔穴再現(xiàn)了模板分子的大小、形狀、空間結(jié)構(gòu)和表面化學性質(zhì)；(2)識別專一性：模板分子在經(jīng)過單體、交聯(lián)劑的共同作用下聚合形成的剛性空腔、功能單體的特定取向以及表面化學的優(yōu)良匹配性決定了這些孔穴稍后將優(yōu)先結(jié)合模板分子而不是結(jié)構(gòu)類似物，從而達到類似于抗原-抗體的專一性識別作用機制。一般而言，識別位點數(shù)量越多，位點的識別性越好；(3)高度穩(wěn)定性：分子印跡技術所制備的共聚物是化學合成產(chǎn)物，具有優(yōu)良的環(huán)境耐受性、耐高溫、耐酸堿和顯著地機械性能；(4)高效利用率：可重復使用且壽命長、造價低廉，相比天然生物分子，無需擔心失活；(5)廣泛實用性：生產(chǎn)分子印跡不需要經(jīng)過復雜的生物反應過程，可使制備效率大大提高。

分子印跡技術已廣泛應用于色譜分離[11]、模擬酶催化[12]、臨床藥物分析[13]和萃取分離[14]等領域，并且在檢測傳感技術領域的應用取得了長足進展[15-16]。分子印跡聚合物不僅具有對目標物質(zhì)的專一識別能力，同時具有生物敏感材料如酶、激素等所缺少的高穩(wěn)定性的特點，因而分子印跡傳感器是生物傳感器的理想發(fā)展方向之一。

圖1 分子印跡過程示意圖[7]Fig.1 Schematic representation of the molecular imprinting process [7]

3 分子印跡光學傳感器

生物傳感器的研究已成為近年來研究的熱點，通過對2000～2018 年間發(fā)表在Science Direct (Elsevier)數(shù)據(jù)庫的相關文獻的統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)科學家們對電化學生物傳感器和光學生物傳感器的研究最為廣泛。電化學生物傳感器具有靈敏度高、選擇性好、響應速度快、成本低、易于操作和微型化等優(yōu)點，是一種功能強大的分析檢測工具[17-19]，然而電極材料的選擇以及標簽化檢測往往使電化學生物傳感器達不到所需的靈敏度和檢測限要求。光學生物傳感器由于光學元件本身良好的絕緣屏蔽作用，具有抗干擾能力強，不受周圍電磁場的擾動；不需要參考電極，探頭可小型化，操作方便；可以實現(xiàn)遙測，并能進行實時、在線和動態(tài)檢測；響應速度快，靈敏度高等優(yōu)點[20-21]。近十年來，光學生物傳感器的研究呈指數(shù)級增長。將光學生物傳感器實時的檢測技術與分子印跡高效專一的特點相結(jié)合的分子印跡光學傳感器，具有高精度、高靈敏度、專一性強及快速、便捷、實時等優(yōu)點，是一種可以直接檢測目標物質(zhì)含量的生物傳感器，在多樣本分析環(huán)境中特點尤其突出[22]。

分子印跡光學傳感器中，MIPs 的主要任務是快速綁定目標生物分子并進行特異性識別，是傳感器中的敏感識別元件；以光單元為信號轉(zhuǎn)換元件，將識別的生物分子信號實時轉(zhuǎn)換為光信號，在通過讀取光信號數(shù)據(jù)從而實現(xiàn)對目標分子的快速定性定量檢測，其原理示意見圖3。其中，分子印跡聚合物對目標分子的專一性識別是分子印跡光學傳感器的的關鍵限速步驟[23-24]。目前，基于熒光(fluorescence)[25-32]、表面等離子體 共 振 (surface plasmon resonance, SPR)[33-38]、共振光散射 (resonance light scattering spectroscopy, RLS)[39]、 光 纖(optical fibers, OFS)[40]、電化學發(fā)光 (electro-chemiluminescence,ECL)[41-46]等分子印跡生物傳感器已有大量的文獻報道，得益于光學傳感的高靈敏度，分子印跡光學傳感器對生物樣本的檢測極限通?？蛇_到納克級[29-31,33,41,45]。

圖2 2000～2018 年生物傳感器發(fā)表文獻數(shù)量變化對比Fig.2 Numbers of published biosensor literatures during 2000～2018

圖3 分子印跡光學傳感器原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of molecular imprinted optical biosensors

3.1 MIP-熒光傳感器

分子印跡熒光傳感器以MIP 作為分子識別元件，以熒光信號為檢測信號對目標物進行定性、定量檢測，具有靈敏度高、選擇性好、檢測限低、用量少、分析時間短以及易于可視化等優(yōu)點[54]。由于大多數(shù)復雜環(huán)境中的目標物質(zhì)本身不具有發(fā)光性質(zhì)，需通過熒光材料間接檢測非熒光分析物。具有熒光團的物質(zhì)可直接作為功能單體參與形成空腔，也可利用 MIPs 包埋熒光材料，利用目標分子與熒光材料的熒光猝滅或增強效應分析待測物質(zhì)含量。近年來，基于量子點(quantum dot, QD)、有機染料、化學發(fā)光反應物質(zhì)以及一些其他熒光材料的分子印跡熒光傳感器的構(gòu)建與應用相當廣泛[55-58]。

QD 作為新一代熒光發(fā)光材料，具有量子尺寸效應和介電限域效應，表現(xiàn)出激發(fā)波長范圍寬、發(fā)射波長范圍窄和斯托克斯位移大等獨特的熒光性質(zhì)。與傳統(tǒng)熒光染料相比，量子點還具有光致發(fā)光性能和化學穩(wěn)定性高、水分散性和熒光性能好、以及制備簡單等特點[59]。QDs 作為光學檢測材料結(jié)合分子印跡技術，已廣泛應用于多種生物樣本的檢測[25,27-28,30-32,53]。

PILOTO 等[25]制備了MIP-QD 熒光傳感器，首次嘗試將MIP 和QD 組合用于急性心肌梗死早期診斷標記物-靶向肌紅蛋白(myohemoglobin, Mb)的檢測，該傳感器結(jié)合了 MIP 的低成本、特異性識別及 QD的高靈敏度。該課題組以丙烯酰胺為功能單體、N,N-雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，采用表面印跡及本體印跡兩種方法在CdTe-QDs 表面進行Mb 分子印跡聚合物MIP-QDs 的制備。采用熒光光譜法對MIP-QDs 及其非印跡對應物NIP-QDs 對Mb 檢測性能進行了研究。結(jié)果顯示，在人工合成的人血清樣品中，MIP-QDs 在心肌梗塞標記物的檢測臨界值以下便可檢測Mb。該MIP-QDs 探針對Mb 檢測范圍為0.304～571 pg·mL-1，檢測限是0.045 pg·mL-1。所構(gòu)筑的納米MIP-QDs 對Mb 反應速度快、穩(wěn)定性好、靈敏度高、選擇性強。

圖4 制備MIP-QDs 的印跡策略示意圖[25]Fig.4 Schematic diagram of MIP-QDs imprinting strategies [25]

3.2 MIP-SPR 傳感器

表面等離子共振技術是一種由光激振的金屬表面電子集體震蕩現(xiàn)象[60]。當偏振光以特定角度照射金屬或其他導電材料時，在介質(zhì)(通常是玻璃和液體)與金屬之間的界面發(fā)生全反射，然后產(chǎn)生消逝波。當入射光的入射角和波長滿足一定條件時，產(chǎn)生的消逝波與金屬膜表面的等離子波發(fā)生的共振現(xiàn)象(如圖5 所示)。由于SPR 現(xiàn)象的發(fā)生，使反射光的能量被大幅度地消耗而發(fā)生衰減，這種衰減全反射正是SPR 傳感技術的理論基礎。SPR 傳感器能對無標記的樣品進行實時動態(tài)檢測，具有靈敏度高等突出優(yōu)點[61]。而將SPR 與MIP 聯(lián)用的MIP-SPR 傳感器，不僅可以顯著的提高傳感器的選擇性、識別性，而且可以對目標分子進行分離與富集，簡化了樣品的前處理過程，其應用前景十分廣闊[33-38]。

OSMAN 等[33]研究利用分子印跡技術制備了MIP-SPR 傳感器，用于人血清肌紅蛋白的檢測。通過在SPR 傳感器表面合成了肌紅蛋白印跡聚(羥乙基甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸酯-l-色氨酸甲酯)納米膜，用接觸角測量、原子力顯微鏡、X 射線光電子能譜和橢圓偏振儀對SPR 傳感器進行了表征。研究人員評估了SPR 傳感器在不同濃度范圍的肌紅蛋白溶液和急性心肌梗死患者血清中檢測肌紅蛋白的能力。測定SPR傳感器的檢測限為26.3 ng·mL-1。該方法制備的MIP-SPR 傳感器具有靈敏度高、選擇性好、使用方便、檢測限低以及實時測量能力強等優(yōu)點。

圖5 SPR 原理[62]Fig.5 Schematic diagram of the principle of SPR[62]

3.3 MIP-RLS 傳感器

共振光散射光譜技術自1993 年由Pasternack 公司開發(fā)[63-64]以來，因其靈敏度高、操作簡單、檢測方便等顯著優(yōu)點備受關注。RLS 是光散射的一種特殊現(xiàn)象，即當一束光通過介質(zhì)時，由于介質(zhì)中的粒子直徑遠小于入射光波長，光的散射位于或接近于分子吸收帶時，電子因共振而強烈吸收光的能量并產(chǎn)生再次散射的過程。共振光散射法已被成功應用于生化分析、藥物分析、納米材料等多個研究領域中[65-66]，特別是RLS 信號對蛋白質(zhì)非常靈敏，目前廣泛應用于蛋白質(zhì)與藥物小分子相互作用的研究領域[67]。為實現(xiàn)RLS 技術的特異性檢測，結(jié)合MIP 制備的MIP-RLS 傳感器具有高選擇性、高靈敏度、低成本、實用性強，操作簡單，生物性能優(yōu)良、兼容性好等優(yōu)點，為專一性檢測生物大分子提供了新的方法。

YANG 等[39]基于RLS 技術的優(yōu)勢，研制了一種基于聚多巴胺(polydopamine, PDA)包覆MIPs 的新型RLS 傳感器，用于對甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)的特異性識別。在SiO2納米粒子表面，以PDA包覆的多膜病毒印跡聚合物為識別元件，通過印跡聚合物膜選擇性捕獲目標病毒，從而提高 RLS 強度，并用簡易熒光分光光度計測定光強度的變化，圖6 顯示了病毒MIPs 的制備原理及病毒的檢測機理。通過對人血清中HAV 檢測的評價，成功確定了HAV 印跡的SiO2@PDA NPs 的實際分析性能，并確定檢測限為8.6 pmol·L-1。該傳感器已成功應用于人血清實際樣品中的HAV 的測定，并為解決復雜生物樣品或環(huán)境樣品中高敏感、高選擇性的定量檢測病毒提供了新的技術手段。同時，該方法成功地將RLS 檢測范圍擴展到摩爾質(zhì)量大于100 萬的大分子。

圖6 病毒MIPs 的制備原理及病毒的檢測[39]Fig.6 Preparation principle of virus-MIPs and virus detection[39]

3.4 MIP-OFS 傳感器

光纖是一種光的傳導工具。MIP-光纖生物傳感器結(jié)構(gòu)主要有光源、光纖、MIPs 生物敏感元件以及信號檢測系統(tǒng)等，其中MIPs 與光纖的耦合類似于光極[68]。利用光的全反射原理，當MIPs 選擇性識別目標分子，產(chǎn)生的生物化學信息調(diào)制光纖中傳輸光的物理特性如光的強度、振幅、相位等，再經(jīng)過光探測器和解調(diào)器獲得所需數(shù)據(jù)。MIP-光纖傳感器有較強的選擇性和很高的靈敏度，在分析過程中對真實的復雜生物樣品很友好。由于光纖設計的靈活性和可用性以及探針的相對簡單性，目前已有多種基于光纖的分子印跡生物傳感器，包括光纖布拉格光柵(tilted fiber Bragg grating, TFBG)傳感器[69]和基于有損模式共振(lossy mode resonance, LMR)的光纖傳感器[52]等。

SANDRINE 等[40]將MIPs 和TFBG 折光技術耦合成光纖，制成用于檢測低分子量的芳香增強劑麥芽醇生物傳感器。首先在光纖芯部刻入傾斜的光柵平面，然后通過光聚合將麥芽糖基印跡的 MIPs 固定在表面上的布拉格光柵上。通過對光纖傳輸信號的頻譜分析，得到了不同介質(zhì)中麥芽醇存在時的傳感器響應(如圖7 所示)。研究發(fā)現(xiàn)，該傳感器在1 538 nm 波長處對外界環(huán)境變化最為敏感。因此，通過檢測1 538 nm波長光在純水和被測溶液中的波長漂移量，即可判別溶液中是否存在目標分子并測得濃度。結(jié)果表明，麥芽醇檢測限達到1 ng·mL-1，靈敏度為6.3×108pm·M-1。MIPs-TFBG 傳感器系統(tǒng)可以無標簽、快速、實時測量樣本，并且還具有可重用性、選擇性、低成本、易操作和可遙控等優(yōu)點。

圖7 應用于TFBG 納米傳感器的分子印跡技術的原理圖[40]Fig.7 Schematic diagram of the molecular imprinting technique for TFBG nanosensor application [40]

圖8 MIP/CHIT/GC 電極表面ECL 傳感器系統(tǒng)示意圖[41]Fig.8 Schematic diagram of the ECL sensor system at the MIP/CHIT/GC electrode surface [41]

3.5 MIP- ECL 傳感器

MIP- ECL 傳感器是將電化學發(fā)光技術與分子印跡技術相結(jié)合的分析檢測技術。由于結(jié)合了ECL 的靈敏性、可控性及MIP 的特異識別性，MIP-ECL 具有通用性的光學裝置、良好的控制以及具有靈敏度高、線性范圍寬、檢測限低等優(yōu)點引起了關注[70-71]。LI 等[41]采用表面單分子定向技術，在3-甲基丙烯基丙基三甲氧基硅烷改性二氧化硅顆粒表面制備了核-殼印跡納米粒子。他們將核-殼印跡納米顆粒/殼聚糖復合膜沉積在裸露的玻碳電極表面，采用氫氟酸蝕刻法去除復合膜上的硅核制備ECL 用以檢測甲基噻吩磺隆(如圖 8 所示)。所得到的 ECL 傳感器線性范圍為 5.0×10-10～1×10-7mol·L-1，甲基噻吩磺隆的檢測限為0.32 nmol·L-1。MIP-ECL 傳感器具有靈敏度高、速度快、特異性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。

在過去的幾年里，分子印跡光學生物傳感器在生物大分子檢測領域得到了長足的發(fā)展，其檢測類型(機理)及檢測能力總結(jié)如表1 所示。

表1 光學分子印跡傳感器應用發(fā)展實例總結(jié)Table 1 Summary of application and development of optical molecular imprinted sensors

4 結(jié) 論

分子印跡光學生物傳感器的檢測從小分子開始，目前已經(jīng)擴展到生物大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、病毒甚至整個細胞。然而，由于模板分子的大小及結(jié)構(gòu)不同，分子印跡傳感器對目標分子檢測的選擇性和敏感性仍然存在很大的差異。生物大分子如蛋白質(zhì)，由于尺寸大、穩(wěn)定性有限、結(jié)構(gòu)復雜、傳質(zhì)慢以及過于柔性的表面結(jié)構(gòu)，使其利用印跡傳感器檢測仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)[72]。得益于納米新材料的應用，磁性納米顆粒、納米線、二氧化硅納米顆粒、碳納米管和量子點都是合成生物大分子印跡聚合物薄層的優(yōu)良載體材料[73]，克服了生物大分子印跡的局限性。這些納米載體具有較大的比表面積，增加了對生物大分子的有效印跡位點。而印跡薄層緩解了大分子質(zhì)量傳輸速度慢的問題，提高了分子印跡光學生物傳感器對目標生物大分子的選擇性和敏感性。隨著分子印跡技術的發(fā)展，人們正在積極探索將其最終應用于痕量大分子檢測，這對生物學領域、醫(yī)學檢測與診斷領域具有非常深刻的意義[74-76]。

目前，分子印跡光學生物傳感器進一步研究和創(chuàng)新的挑戰(zhàn)在于(1)光學檢測原理還不十分明確，如何將化學或生物信號轉(zhuǎn)換成光學信號并進行放大還需進行更深入的研究，以期實現(xiàn)更高的檢測效率；(2)MIPs 與光學載體的耦合方式是決定傳感性能的主要因素，但目前還沒有相關的系統(tǒng)研究；(3)生物樣本的檢測對傳感器的高通量、高重復性性能有較高要求，而關于這方面的研究還鮮有報道。

由于分子印跡光學傳感器具有小型化和便攜化等優(yōu)點可以使檢測更具有時效性，在醫(yī)學、制藥、環(huán)境、食品等領域應用前景十分廣闊。文獻中雖然有許多成功的MIP 在光學傳感器中的應用，然而只有很少的例子涉及真實的生物樣品，包括在復雜環(huán)境中檢測目標蛋白質(zhì)等生物大分子。未來的發(fā)展方向包括如何在真實生物環(huán)境和復雜基質(zhì)中增強特定的分子親和力、開發(fā)具有多路復用能力的多感官 MIPs-光學傳感器，并提高其實際應用的靈敏度、選擇性和重現(xiàn)性。此外，更低的成本和更好地從實驗室轉(zhuǎn)化為大規(guī)模生產(chǎn)對商業(yè)化也很重要。

隨著分子印跡技術及光學檢測技術的發(fā)展，分子印跡光學生物傳感器將會更加完善與成熟。