（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224）

藍(lán)舌病（bluetongue，BT）是一種由藍(lán)舌病病毒（bluetongue virus，BTV）感染引起的烈性出血性動(dòng)物疫病。BTV 主要通過(guò)庫(kù)蠓屬（Culicoidesspp.）雌性昆蟲(chóng)的吸血叮咬傳播，能夠感染牛、羊、駱駝和鹿等多種家養(yǎng)及野生反芻動(dòng)物[1]。BTV感染綿羊后可引起較高的發(fā)病率和病死率[2-4]。而牛和山羊感染BTV 后往往無(wú)明顯的臨床癥狀，在BTV 傳播過(guò)程中扮演了病毒儲(chǔ)存庫(kù)角色[3-4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，BT 對(duì)全球畜牧業(yè)生產(chǎn)每年造成約30 億美元的經(jīng)濟(jì)損失，因此被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報(bào)動(dòng)物疫病[5-6]。

BTV 屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬（Orbivirus），其基因組由10 條（genomic segment 1～10，Seg-1～10） 雙 鏈RNA（doublestranded RNA，dsRNA）片段組成，可編碼7 種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～7）和5 種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1～4 以及NS3a）[7]。Seg-2/VP2 是BTV 變異程度最高的成分。VP2 能夠誘導(dǎo)被感染動(dòng)物產(chǎn)生特異性中和抗體，對(duì)病毒血清型（serotype）具有決定性作用[7-8]。2008年至今，世界范圍新發(fā)現(xiàn)了4 種BTV 新血清型（BTV-25～28）。因此，BTV 血清型由過(guò)去的24 種增加至28 種（BTV-1～28）[9-12]。

雖然VP3 序列在BTV 毒株間高度保守，但編碼該蛋白的Seg-3 序列隨BTV 毒株流行地域不同而出現(xiàn)差異，因此可以根據(jù)其序列差異，將世界范圍內(nèi)BTV 毒株劃分為東方（Eastern）和西方（Western）兩種主要的地域型（topotype）[13-14]。與VP3 類(lèi)似，VP7 和NS3 蛋白的保守程度也較高，其編碼節(jié)段Seg-7 和Seg-10 的序列變異也與BTV毒株流行地域密切相關(guān)，可根據(jù)Seg-7 和Seg-10的序列差異，將世界范圍內(nèi)BTV 毒株分為東方和西方兩種主要的地域型以及數(shù)種地域亞型[13]。Seg-3、-7 和-10 序列具有強(qiáng)烈的地域特征，因此進(jìn)行上述基因組節(jié)段序列分析，能夠?yàn)樽匪莶《酒鹪刺峁┮罁?jù)[13-15]。

我國(guó)1979 年首次在云南省師宗縣綿羊中記錄了BT 的暴發(fā)[16]。之后，湖北省、安徽省、四川省和山西省相繼暴發(fā)BT，并陸續(xù)分離到BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15 和-16 型毒株，其中BTV-1和BTV-16 型在我國(guó)流行廣泛，并且都能夠?qū)е戮d羊出現(xiàn)較明顯的臨床癥狀[17-19]。2012 年以來(lái)，在國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）專(zhuān)項(xiàng)資助下，云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院在云南省、廣西壯族自治區(qū)、廣東省、湖北省、江蘇省、山西省、新疆維吾爾自治區(qū)和內(nèi)蒙古自治區(qū)等8 個(gè)省份設(shè)立哨兵動(dòng)物，共分離到12 種血清型BTV 毒株（BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21 和-24）[20-23]。

多種血清型BTV 在我國(guó)廣泛流行，不同血清型毒株間缺乏交叉保護(hù)，病毒通過(guò)突變和基因重配，不斷產(chǎn)生變異毒株[17，20，22]，這些都為當(dāng)前的BT 防治工作帶來(lái)了挑戰(zhàn)。對(duì)我國(guó)不同歷史時(shí)期的BTV 流行毒株進(jìn)行序列比較分析，有助于掌握BTV 的演化特征以及我國(guó) BTV 流行毒株的溯源分析。雖然本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)完成了2012 年以來(lái)我國(guó)不同血清型BTV 分離毒株的全基因組測(cè)序，但對(duì)1995—1997 年云南省BTV 流行毒株的遺傳特征尚不清楚。因此，對(duì)1995—1997 年分離自云南省分屬7 種血清型的25 株BTV 毒株的Seg-2、-3、-7 和-10基因節(jié)段進(jìn)行了擴(kuò)增、測(cè)序和遺傳特征分析，以期為我國(guó)BTV 的演化分析與溯源研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和minimum Eagle's medium（MEM） 培養(yǎng)基，購(gòu)自Thermo Scientific 公司；一步法RT-PCR 試劑盒HiScript ⅡOne Step RT-PCR Kit（Dye Plus），購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒和Universal DNA 膠回收純化試劑盒，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2 細(xì)胞、毒株和病毒培養(yǎng)

幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（baby hamster kidney cells，BHK-21），由本實(shí)驗(yàn)保存；25 株BTV 毒株，1995—1997 年分離自云南省師宗、芒市、景洪、峨山等地設(shè)立的哨兵牛，病毒分離信息見(jiàn)表1。將分離的BTV 毒株接種BHK-21 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）達(dá)到90%時(shí)刮下細(xì)胞，4 ℃ 8 000 r/min 離心15 min，棄去沉淀，將病毒液分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 中公布的BTV 毒株序列，采用Oligo 7.0 軟件設(shè)計(jì)10 對(duì)引物，分別用于擴(kuò)增7 種BTV 血清型毒株的Seg-2、-3、-7 和-10（表2）。引物委托上海捷瑞公司合成，以聚碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理水稀釋至終濃度為10 μmol/L 備用。

表1 1995—1997 年云南省BTV 分離毒株信息

1.4 RT-PCR 擴(kuò)增與測(cè)序

采用病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒抽提病毒核酸，將核酸于94 ℃變性3 min 后，立即冰浴。分別取5 μL變性核酸為模板，使用表2中的引物對(duì)，采用一步法RT-PCR，對(duì)BTV 分離毒株的Seg-2、-3、-7 和-10 進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：2×One Step Mix（Dye Plus）25 μL，One Step Enzyme Mix 2.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，核酸模板5 μL，以無(wú)RNA酶水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件如下：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35 個(gè)循環(huán)。利用Universal DNA 膠回收純化試劑盒，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳膠回收，以PCR 擴(kuò)增的上、下游引物作為測(cè)序引物，對(duì)純化的DNA 進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.5 序列分析與系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建

使用DNAstar 軟件（Ver 6.0），對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接組裝；利用MEGA 6.0 軟件[24]，進(jìn)行序列比對(duì)分析。采用最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)：Seg-2 序列選擇“GTR+G”模型，Seg-3 序列選擇“TN93+G+I”模型，Seg-7 序列選擇“GTR+G+I”模型，Seg-10序列選擇“T92+G”模型，自舉檢驗(yàn)（bootstrap）取值1 000。序列相似度，以平均數(shù)（mean）表示。本研究中獲取的序列以黑色菱形符號(hào)表示。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)中其他國(guó)家分離的BTV 毒株序列以“GenBank序列號(hào)_BTV 血清型_分離國(guó)家_病毒分離時(shí)間”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Seg-2、-3、-7 和-10 的RT-PCR 擴(kuò)增

表2 云南省BTV 分離毒株Seg-2、-3、-7 和-10 的RT-PCR 擴(kuò)增引物信息

設(shè)計(jì)10 對(duì)引物（表2），對(duì)分離的25 株BTV 毒株Seg-2、-3、-7 和-10 進(jìn)行一步法RTPCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，7 對(duì)針對(duì)不同血清型Seg-2的引物均能夠特異性地?cái)U(kuò)增出大小約為1 200 bp，與預(yù)期大小相符的DNA 片段，而針對(duì)Seg-3、-7和-10 的3 對(duì)引物，也能夠特異性擴(kuò)增出大小分別為1 100、1 100 和800 bp，與預(yù)期大小相符的目的DNA 片段。

2.2 Seg-2 序列分析

序列比對(duì)分析顯示，云南省1995—1997 年分離的25 株BTV 毒株分屬BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15 和-16 型等7 種血清型。世界范圍內(nèi)27種血清型（BTV-1～27）BTV 毒株的Seg-2 可分為12 種基因型（Nucleotype A—L）[13，15]。在系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上，本研究中的25 株BTV Seg-2 與對(duì)應(yīng)血清型BTV 參考毒株聚為一簇，分屬A、B、H、I、G 和J等6 種基因型，與對(duì)應(yīng)血清型BTV 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)參考毒株的Seg-2 序列相似度大于68.10%，VP2 序列相似度大于75.00%（圖1～2），表明早期通過(guò)血清中和試驗(yàn)對(duì)BTV 血清型鑒定結(jié)果的正確性。云南省分離的同一種血清型BTV 的Seg-2/VP2 序列高度相似，Seg-2 核苷酸序列相似度在92.80%～100%之間，VP2 氨基酸序列相似度在96.90%～100%之間（圖2），表明云南省流行的同一血清型BTV 的Seg-2 有著最近的共有祖先。

研究發(fā)現(xiàn)，同種血清型BTV 毒株Seg-2 之間，其序列也存在較大差異，并可根據(jù)這種差異，將同一血清型BTV 的Seg-2 分為東方地域型（Eastern topotype） 和西方地域型（Western topotype）[13，15]。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)顯示，云南省分離的2 株BTV-12 型毒株（B139 和B334）的Seg-2 與南非BTV-12 型毒株聚為一簇，序列相似度大于98.10%，屬于Western 地域型。云南省分離的BTV-1、-2、-3、-4、-15 和-16 型等毒株的Seg-2 與分離自日本、印度和澳大利亞的同血清型毒株聚為Eastern 地域型，其Seg-2 序列相似度在89.03%～95.46%之間，VP2 序列相似度在90.92%～98.30%之間；與同血清型Western 地域型毒株的Seg-2 序列相似度在68.00%～95.81%之間，VP2 序列相似度在75.28%～97.14%之間（圖1～2）。

2.3 Seg-3 序列分析

Seg-3 序列比對(duì)分析顯示，本研究的25株BTV 毒株間Seg-3 核苷酸序列相似度在79.35%～93.93%之間，VP3 氨基酸序列相似度在96.83%～99.95% 之間（圖2）。構(gòu)建的Seg-3 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)顯示，云南省分離的25 株BTV 毒株與來(lái)自中國(guó)臺(tái)灣、澳大利亞和印度等地的毒株一同構(gòu)成Eastern 地域型（圖3）。本研究中的25 株BTV 與國(guó)外分離的Eastern 地域型、Western 地域型和新血清型（BTV-25～28）毒株間Seg-3 序列相似度在74.63%～89.29%之間，VP3 序列相似度在88.69%～99.12%之間（圖2）。在Eastern地域型內(nèi)部，4 株云南省分離的BTV-15 型毒株與1 株澳大利亞的BTV-15 型毒株聚為相對(duì)獨(dú)立的一簇，構(gòu)成遠(yuǎn)東地域亞型（Far Eastern topotype）（圖3）[15]，與Eastern 地域型其他毒株以及Western 地域型、新血清型（BTV-25～28）毒株間的Seg-3/VP3 序列相似度在75.18%～79.60%/88.20%～96.83%之間（圖2）。這一方面表明云南省與澳大利亞的BTV-15 型毒株Seg-3 有著共同的起源，另一方面也表明該基因節(jié)段在進(jìn)化上的相對(duì)獨(dú)立性。

2.4 Seg-7 序列分析

圖1 1995—1997 年云南省BTV 分離毒株Seg-2 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

云南省不同血清型BTV 毒株間Seg-7 核苷酸序列相似度在73.85%～94.36%之間，VP7 氨基酸序列相似度在85.96%～99.35%之間（圖2）。Maan等[13]的研究顯示，BTV 的Seg-7 可分為3 種東方地域亞型（Eastern topotype 1～3）和7 種西方地域亞型（Western topotype 1～7）。云南省分離的21 株BTV 毒株的Seg-7 分屬Eastern topotype 1～3地域亞型，分別與來(lái)自中國(guó)臺(tái)灣、日本、印度和澳大利亞等地毒株的Seg-7 享有最近的親緣關(guān)系（圖4）。值得注意的是，云南省4 株BTV 的Seg-7 屬于Western 地域型：云南省BTV-2 型毒株（B238）和BTV-12 型毒株（B139 和B334） 的Seg-7 屬于Western topotype 1 地域亞型，與南非毒株具有最近的親緣關(guān)系[13]，序列相似度大于98.60%；BTV-16 型（B034）毒株為Western topotype 3 地域亞型，與荷蘭毒株（GQ506478）和南非毒株（GQ506512）具有最近的親緣關(guān)系，序列相似度均為95.60%（圖4）。上述4 株BTV 毒株的Seg-7 序列相似度在78.90%～100%之間，VP7 序列相似度在94.60%～100%之間，而與云南省分離的Eastern 地域型毒株的Seg-7/VP7 序列相似度分別在78.33%～79.07%/94.46%～95.74%之間（圖2）。

2.5 Seg-10 序列分析

云南省分離的25 株BTV 毒株的Seg-10 核苷酸序列相似度在86.61%～94.68%之間，NS3 氨基酸序列相似度在95.00%～99.08%之間（圖2）。BTV 毒株Seg-10 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)顯示，該基因節(jié)段序列被劃分為2 個(gè)東方地域亞型（Eastern topotype 1～2） 和3 個(gè)西方地域亞型（Western topotype 1～3）（圖5）[13]。云南省分離的22 株BTV 毒株的Seg-10 均屬于Eastern topotype 1 地域亞型，分別與來(lái)自中國(guó)臺(tái)灣、日本、印度和澳大利亞等地毒株的Seg-10 享有最近的親緣關(guān)系（圖5）。而3 株云南省分離的BTV-15 型毒株（B105、B358和B359）單獨(dú)構(gòu)成Eastern topotype 2 地域亞型，與其他地域亞型毒株間Seg-10/NS3 序列相似度則在76.93%～85.81%/83.41%～97.26% 之間（圖2、圖5）。本研究中的25 株BTV 與Eastern topotype 1 地域亞型內(nèi)其他毒株、Eastern topotype 2 地域亞型和Western 地域型亞型毒株間的Seg-10 序列相似度在77.02%～91.37%之間，NS3 序列相似度在83.23%～97.55%之間（圖2、圖5）。

圖2 1995—1997 年云南省BTV 分離毒株核苷酸/氨基酸序列相似度

3 討論

云南省復(fù)雜的地理環(huán)境和氣候條件造就了該地區(qū)動(dòng)物、植物和病毒的天然多樣性。云南省地處我國(guó)邊境地區(qū)，與越南、老撾和緬甸等多國(guó)接壤，家畜及畜產(chǎn)品貿(mào)易頻繁，動(dòng)物疫病跨境傳播風(fēng)險(xiǎn)較高。多種血清型BTV 在云南省廣泛流行，說(shuō)明該地區(qū)在我國(guó)BT 防控中具有舉足輕重的地位。過(guò)去認(rèn)為BTV 主要流行于南緯35°至北緯40°之間。但是，隨著氣候變暖、庫(kù)蠓活動(dòng)范圍擴(kuò)大和潛在傳播蟲(chóng)媒種類(lèi)增多，BT 有逐漸向寒冷的高海拔和高緯度地區(qū)擴(kuò)散的趨勢(shì)[2，25-27]，對(duì)我國(guó)北方地區(qū)的牛羊養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成了威脅。掌握云南省1995—1997 年BTV 流行毒株的遺傳背景，能夠?yàn)榉治鑫覈?guó)BTV演化特征，進(jìn)行病毒擴(kuò)散與溯源分析提供寶貴的序列信息。

圖3 1995—1997 年云南省BTV 分離毒株Seg-3 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

圖4 1995—1997 年云南省BTV 分離毒株Seg-7 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

圖5 1995—1997 年云南省BTV 分離毒株Seg-10 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

1995—1997 年，本實(shí)驗(yàn)室在云南省分離出7種血清型BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15 和-16），2012 年至今，在云南省哨兵動(dòng)物中分離出11 種血清型BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-5、-9、-12、-15、-16、-21 和-24）[17-23]，表明云南省流行的BTV 血清型具有多樣性。BTV-5、-9、-21 和-24等4 種血清型BTV 在云南省的首次發(fā)現(xiàn)，提示我國(guó)可能還有其他血清型BTV 存在，因此對(duì)我國(guó)流行BTV 多樣性的監(jiān)測(cè)仍是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程。病毒所處的生態(tài)環(huán)境不同，施加的選擇壓力不同，病毒的基因進(jìn)化就會(huì)呈現(xiàn)出特定的地域特征。本研究發(fā)現(xiàn)，云南省流行的BTV 毒株序列也呈現(xiàn)出特有的地域特征：云南省流行的BTV-15 型毒株的Seg-3 形成了獨(dú)立于Eastern 地域型和Western 地域型的進(jìn)化分支（Far Eastern topotype），BTV-1和BTV-16 型毒株的Seg-2 也形成了獨(dú)立的進(jìn)化支系，BTV-15 型毒株的Seg-10 形成獨(dú)立的Eastern topotype 2 地域亞型，揭示了云南省流行的BTV 在進(jìn)化上的獨(dú)特性。

Western 地域型BTV 毒株侵入云南省后，在傳播過(guò)程中與我國(guó)本地流行毒株發(fā)生了基因重配，與同屬環(huán)狀病毒屬的流行性出血病病毒（epizootic hemorrhagic disease virus，EHDV）某些血清型間Seg-7 較難發(fā)生重配不同[28-29]，BTV 毒株的Seg-7片段能夠在自然環(huán)境中發(fā)生相對(duì)自由的重配，提示BTV 進(jìn)化可能主要由基因重配驅(qū)動(dòng)，使病毒更適合在當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)系統(tǒng)中傳播和生存[20]。

本研究通過(guò)分析1995—1997 年分離自云南省分屬7 種血清型的25 株BTV 毒株Seg-2、-3、-7和-10 的遺傳特征，發(fā)現(xiàn)云南省存在多種血清型BTV 流行，既有本地長(zhǎng)期流行的BTV-1 型和BTV-16 型毒株，也有Western 地域型BTV 毒株侵入云南省后發(fā)生重配的毒株，提示我國(guó)BT 防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻。本研究為分析我國(guó)BTV 毒株的突變和基因重配提供了第一手資料，為追溯我國(guó)BTV 毒株來(lái)源提供了依據(jù)。