孫翔翔，王 萍，劉蒙達(dá)，樊曉旭，孫世雄，張培培，田莉莉，孫明軍

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.山東新希望六和集團(tuán)有限公司，山東青島 266100）

Q 熱是由伯氏柯克斯體（Coxiella burnetii）感染導(dǎo)致的一種自然疫源性人獸共患病，在全球分布廣泛，幾乎所有國家均有動物感染的報道，包括牛、羊在內(nèi)的多種動物均對其易感[1]。奶?；糛 熱后可通過胎盤、乳汁和糞尿等排出病原，或經(jīng)蜱蟲叮咬傳播給其他動物，主要表現(xiàn)體重下降、產(chǎn)奶量減少等癥狀，甚至出現(xiàn)流產(chǎn)和產(chǎn)死胎等現(xiàn)象，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2]。為了解該病在規(guī)模奶牛場的流行情況，在我國北方地區(qū)7 個規(guī)模奶牛場采集233 份奶牛血清進(jìn)行Q 熱抗體檢測，同時采集103 份棉拭子進(jìn)行Q 熱病原檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 奶牛血清和鼻腔棉拭子，采集自我國北方地區(qū)7 個規(guī)模場；Q 熱抗體檢測試劑盒，購自IDEXX 公司；熒光定量PCR 試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.2 儀器 酶標(biāo)儀，購自美國TECAN 公司；實時定量熒光PCR 儀Quant Studio3，購自Thermo Fisher 公司；各種型號移液器，購自Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 血清學(xué)檢測 按照Q 熱抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行。使用前將所有試劑恢復(fù)至室溫，并輕輕渦旋混勻；配制1×洗滌溶液；在每個微量反應(yīng)板的孔中，加入100 μL 已稀釋好的樣品；在2 個適當(dāng)孔，分別加入100 μL 未稀釋的陽性對照，2 個適當(dāng)孔分別加入100 μL 未稀釋的陰性對照；使用微量板振蕩器充分混勻孔中內(nèi)容物，蓋上蓋板，37 ℃條件下孵育1 h；用300 μL 左右的洗滌溶液，對每個板孔洗滌3 次；每次洗滌后吸去每個板孔中的液體，最后一次甩板后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余液體；每孔加入100 μL 酶標(biāo)抗體，蓋上蓋板，37 ℃條件下孵育1 h；重復(fù)洗板步驟；每孔加入100 μL 底物溶液，室溫下避光孵育15 min；每孔加入100 μL 終止液，輕輕晃動反應(yīng)板，測量并記錄樣品和對照在450 nm 波長下的吸光值。陽性對照OD 平均值不應(yīng)大于2.5，陰性對照OD 平均值不應(yīng)大于0.5，陽性對照和陰性對照OD 差值應(yīng)大于0.3，試驗方有效。S/P=（樣品OD 值-陰性對照平均OD 值）/（陽性對照平均OD 值-陰性對照平均OD 值）×100%。S/P＜30%，判為陰性；30%≤S/P＜40%，判為可疑，需重新檢測；S/P≥40%，判為陽性。

1.2.2 病原學(xué)檢測 采用《OIE 陸生動物診斷與疫苗手冊》3.1.16 章推薦的熒光定量PCR 方法[3]。針對Q 熱病原IS1111特異性靶基因設(shè)計引物和探針（表1），按照試劑盒說明書進(jìn)行核酸擴(kuò)增。熒光定量 PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序為：2×One Step RT-PCR Buffer 12.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、探針 0.25 μL、ddH2O 8.25 μL；50 ℃2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)45 次。任意一孔陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果或任意一孔陽性對照出現(xiàn)陰性結(jié)果，提示本次熒光定量PCR 檢測無效，應(yīng)重新開展檢測；Ct 值小于38，判為陽性，大于38，判為陰性。

表1 Q 熱病原引物和探針信息

2 結(jié)果

在7 個規(guī)模場采集的233 份血清樣品中，共檢測到Q 熱抗體陽性34 份，平均血清學(xué)陽性率為14.59%；在采集的103 份棉拭子樣品中，檢測到Q 熱病原陽性樣品12 份，平均病原學(xué)陽性率為11.65%（表2）。

3 討論

本次檢測發(fā)現(xiàn)，7 個規(guī)模場均檢測到血清學(xué)陽性，6 個場均檢測到病原陽性，說明Q 熱在我國北方規(guī)模場中流行較為廣泛。但不同規(guī)模場的流行情況并不一致，陽性率介于3%～33%，提示可能處于不同的感染時期。規(guī)模場3 未檢測到病原核酸，但血清學(xué)陽性率為12%，說明可能曾有過感染；規(guī)模場4 未檢測到血清學(xué)陽性，但病原學(xué)陽性率為12%，提示可能處于感染初期；規(guī)模場6 病原陽性率最高（33%），但血清學(xué)陽性率卻較低（4%），提示可能處于感染初期的奶牛數(shù)量較多；規(guī)模場7 病原學(xué)陽性率為18%，但血清學(xué)陽性率卻高達(dá)32%，提示可能臨近感染末期。

表2 樣品檢測結(jié)果 單位：份

Q 熱病原可通過氣溶膠感染人和動物。國內(nèi)外均有Q 熱流行的報道[4]。上海市某規(guī)模牛場Q熱血清學(xué)監(jiān)測顯示，抗體陽性率在35%以上[5]；新疆9 個地區(qū)的牛場中有6 個地區(qū)發(fā)現(xiàn)Q 熱，陽性率約為30%[6]；甘肅省南部地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查顯示，56 份牛樣品中5 份為Q 熱抗體陽性[7]；100 份青海牦牛血清中，檢測到27 份Q 熱抗體陽性[8]。埃及流行病學(xué)調(diào)查報道顯示，牛Q 熱抗體陽性率約為19.3%[9]；加納部分地區(qū)牛Q 熱抗體陽性率為21.7%[10]；斯洛文尼亞流行病學(xué)調(diào)查顯示，牛Q 熱血清學(xué)陽性率高達(dá)46%[11]。本次檢測結(jié)果顯示，7個規(guī)模奶牛場均存在不同程度的、處于不同時期的伯氏柯克斯體感染，應(yīng)引起養(yǎng)殖場的高度重視，做好Q 熱的應(yīng)對工作，以防引起流產(chǎn)，甚至導(dǎo)致人員感染。

由于受采樣數(shù)量、采樣地區(qū)等的局限性影響，本次針對規(guī)模場奶牛的血清學(xué)和病原學(xué)調(diào)查結(jié)果并不能真實反映我國所有規(guī)模場的Q 熱流行情況，因此有必要加強(qiáng)Q 熱的流行病學(xué)調(diào)查研究，進(jìn)一步開展監(jiān)測，掌握Q熱在畜間的真實流行病學(xué)資料，以控制該病的傳播。

此外，還應(yīng)加強(qiáng)Q 熱新型診斷技術(shù)研發(fā)[12]，為快速、特異和高效診斷該病提供技術(shù)支撐。