李璐 趙明 魏執(zhí)真 蘇敬澤 李英驥

調(diào)脈飲是北京中醫(yī)醫(yī)院魏執(zhí)真教授從長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中總結(jié)出來的治療快速性心律失常的有效方劑[1]，全方以益氣養(yǎng)心、理氣通脈、涼血清熱為法，并進(jìn)行了調(diào)脈飲治療實(shí)驗(yàn)性心律失常的經(jīng)典藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)[2-3]、心肌細(xì)胞電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)[4]、心臟形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)[5]、神經(jīng)體液內(nèi)分泌實(shí)驗(yàn)[6]以及細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[7-9]等涉及整體、系統(tǒng)、器官、細(xì)胞和分子的不同層次、大量深入的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示，調(diào)脈飲治療實(shí)驗(yàn)性心律失常有肯定、良好的療效，具有多途徑、多層面、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制[10]。本研究旨在利用膜片鉗技術(shù)觀察調(diào)脈飲對(duì)全部心臟離子通道的作用，進(jìn)一步深入探討調(diào)脈飲抗心律失常的分子機(jī)制。

心肌細(xì)胞離子通道與心律失常的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，也是心律失常藥物開發(fā)的重要靶點(diǎn)。本研究采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察調(diào)脈飲對(duì)快速延遲整流鉀通道(rapidly activating delayed rectifier potassuim channel，Ikr，hERG)、鈉通道1.5亞型(sodium channel subtype 1.5，NaV1.5)、鈣通道1.2亞型(calcium channel subtype 1.2，L-type，CaV1.2)、慢激活延遲整流鉀通道(slowly activating delayed rectifier potassuim channel，Iks, KV7.1)、超快延遲整流鉀通道(ultra-rapid delayed rectifier potassium channel，IKur，KV1.5)、瞬時(shí)外向鉀通道(transient outward potassium channel，Ito，KV4.3)、內(nèi)向整流鉀通道(inward rectifier potassium channel，Kir2.1)、ATP敏感性鉀通道(ATP sensitive potassium channel，KATP)、鈣通道3.2亞型(calcium channel subtype 3.2，T-type，Cav3.2)、乙酰膽堿敏感性鉀通道(acetylcholine-sensitive potassium channel，KAch)、超極化激活的陽(yáng)離子電流亞型2(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channel subtype 2，HCN2)和HCN4以及多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞(induced pluripotent stem cell dericed cardiomyocyte，IPSC-CM)動(dòng)作電位和心臟鈉鈣交換電流(Na+-Ca2+-exchanger，NCX)的作用，旨在觀察調(diào)脈飲對(duì)上述離子通道的干預(yù)作用，探討調(diào)脈飲抗心律失常作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物配制與分組

調(diào)脈飲配方顆粒由北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，組成：太子參30 g、麥冬15 g、五味子10 g、香附10 g、香櫞10 g、佛手10 g、烏藥10 g、丹參10 g、川芎15 g、丹皮15 g、赤芍15 g。取10 mg的中藥配方顆粒加入10 mL細(xì)胞外液中震蕩溶解，40℃超聲后，用0.22微米濾膜過濾，配置成高劑量組(1 mg/mL)，再將1 mg/mL濃度的待測(cè)液體進(jìn)行10倍稀釋配置成低劑量組(0.1 mg/mL)，藥品在溶液中全部溶解，沒有肉眼可見的沉淀。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 離子通道穩(wěn)定表達(dá)的HEK293細(xì)胞和CHO細(xì)胞系 hERG、CaV1.2、NaV1.5、KV7.1、CaV3.2、 KV1.5、 KV4.3、 Kir2.1、KAch、KATP、HCN2、HCN4等心臟離子通道均通過基因克隆方式，在HEK293和CHO細(xì)胞系中進(jìn)行過表達(dá)。過表達(dá)的細(xì)胞系和基因信息見表1。所有細(xì)胞系由北京愛思益普生物科技股份有限公司提供。

穩(wěn)定表達(dá)上述離子通道的HEK293或CHO細(xì)胞系在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，簡(jiǎn)言之，除去舊培養(yǎng)基并用PBS洗細(xì)胞后，然后加入1 mL 0.25%-Trypsin-EDTA溶液 (hERG-HEK293細(xì)胞消化使用TrypLETMExpress)，37℃孵育1 分鐘，將細(xì)胞接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿，接種細(xì)胞量為2.5×105(最終體積：5 mL)。為維持細(xì)胞的電生理活性，細(xì)胞密度必須不能超過80%。實(shí)驗(yàn)之前細(xì)胞用0.25%-Trypsin-EDTA分離，將5×103細(xì)胞鋪到蓋玻片上，在24孔板中培養(yǎng)(最終體積：500 μL)，18 小時(shí)后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

表1 各離子通道穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系

1.2.2 干細(xì)胞誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞 調(diào)脈飲對(duì)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位及鈉鈣交換(NCX)電流在干細(xì)胞誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞上進(jìn)行，干細(xì)胞誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞購(gòu)買于南京柏壽生物科技有限公司(Cauliscell，批號(hào)：2016-4-5)，按照Cauliscell的心肌細(xì)胞處理標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。程序如下：干細(xì)胞誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞不可傳代培養(yǎng)， 每次檢測(cè)需從液氮中復(fù)蘇；將凍存的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞從液氮中取出，置于37℃水浴中快速溶解，將細(xì)胞管移到超凈工作臺(tái)中，用移液器將細(xì)胞輕輕轉(zhuǎn)移至5 mL培養(yǎng)基中；200 g室溫下離心五分鐘， 去掉上清后有培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；提前24小時(shí)用0.1% Gelatin鋪板，細(xì)胞接種于鋪12 mm細(xì)胞爬片的24孔板內(nèi)，密度62500個(gè)/孔；將種植細(xì)胞的24孔板放回37℃并含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每隔2天換一次培養(yǎng)液，大約1周后可觀察到自發(fā)跳動(dòng)的細(xì)胞，此時(shí)可以將細(xì)胞用于電生理記錄。

1.3 電生理記錄[11]

用微電極拉制儀(P97，Sutter Instruments)將毛細(xì)玻璃管(BF150-86-10，Sutter Instruments)拉制成記錄電極。在倒置顯微鏡(IX71，Olympus&AE31E，Motic)下操縱微電極操縱儀(MP285，Sutter Instruments&86PW420600&，MCI )，將記錄電極接觸到細(xì)胞上，給予負(fù)壓抽吸，形成G歐姆封接后進(jìn)行快速電容補(bǔ)償，然后繼續(xù)給予負(fù)壓，吸破細(xì)胞膜，形成全細(xì)胞記錄模式。然后進(jìn)行慢速電容的補(bǔ)償并記錄膜電容及串聯(lián)電阻，不給予漏電補(bǔ)償。當(dāng)全細(xì)胞記錄的電流穩(wěn)定后開始從低濃度到高濃度梯度給藥，每個(gè)藥物濃度作用至5分鐘后檢測(cè)下一個(gè)濃度，在記錄期間獨(dú)立重復(fù)檢測(cè)多個(gè)細(xì)胞。所有電生理實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。按已發(fā)表文獻(xiàn)配置需要檢測(cè)離子通道的細(xì)胞外液及電極液，具體溶液組成及通道電流刺激程序見表2。

1.4 數(shù)據(jù)分析

表2 各種通道使用細(xì)胞內(nèi)外液以及檢測(cè)方法

續(xù)表

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 調(diào)脈飲顆粒對(duì)心臟多種離子通道的作用

結(jié)果顯示，0.1 mg/mL調(diào)脈飲顆粒顯著抑制CaV3.2(18.94%±2.19%)和NCX(28.46%±9.74%)電流，1 mg/mL調(diào)脈飲顆粒顯著抑制hERG(43.29%±0.09%)、CaV3.2(34.72%±0.61%)、KATP(38.44%±2.67%)、HCN4(30.64%±1.94%)和NCX(64.25%±25.29%)電流，并顯著增加緩慢延遲復(fù)極鉀通道KV7.1(34.49%±4.53%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1和圖1。

注：(A)hERG鉀通道、(B) 鈉通道(NaV1.5)、(C)L-型鈣通道(CaV1.2)、(D)T型鈣通道(Cav3.2)、(E)慢激活延遲整流鉀通道(KV7.1)、(F)內(nèi)向整流鉀通道(Kir2.1)、(G)超快激活延遲整流鉀通道(KV1.5)、(H)瞬時(shí)外向鉀通道(KV4.3)、(I)ATP敏感鉀通道(KATP)、(J)乙酰膽堿依賴鉀通道(KAch)、(K)超極化激活的陽(yáng)離子流HCN2、(L)超極化激活的陽(yáng)離子流和HCN4、(M)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞NCX電流。

圖1 調(diào)脈飲顆粒對(duì)心臟離子各通道作用的原始電流圖

2.2 調(diào)脈飲顆粒對(duì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的作用

0.1 mg/L和1 mg/L調(diào)脈飲顆粒對(duì)心臟動(dòng)作電位幅度(APA)和最大去極化速度(dv/dtmax)均無顯著影響。0.1 mg/L調(diào)脈飲顆粒對(duì)APD30、APD50和APD90無顯著影響，但是1 mg/L調(diào)脈飲顆粒顯著延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程APD30、APD50和APD90。調(diào)脈飲顆粒引起的心肌動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)，可以延長(zhǎng)心臟的有效不應(yīng)期，從而產(chǎn)生抗心律失常效應(yīng)。0.1 mg/L和1 mg/L調(diào)脈飲顆粒對(duì)心臟靜息電位(RMP)無顯著影響，輕微增加心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率，P>0.05。

表3 0.1 mg/mL及1 mg/mL調(diào)脈飲顆粒對(duì)各離子通道的作用

表4 不同濃度調(diào)脈飲顆粒對(duì)IPSC誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響

3 討論

調(diào)脈飲是長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中總結(jié)出來的治療快速性心律失常的有效方劑，其在動(dòng)物模型和心肌細(xì)胞的作用已經(jīng)得到充分的驗(yàn)證[1，2，4]，但是，其抗心律失常的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制尚未得到充分的研究。本研究首次運(yùn)用膜片鉗技術(shù)，重組心臟離子通道表達(dá)技術(shù)和人IPSC誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞技術(shù)，篩選了調(diào)脈飲抗心律失常作用的靶點(diǎn)，并研究了調(diào)脈飲對(duì)人IPSC誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞的影響，從而深入探討調(diào)脈飲的抗心律失常機(jī)理。

心臟離子通道參與動(dòng)作電位的形成，目前明確的與心肌動(dòng)作電位發(fā)生相關(guān)的離子通道包括鈉通道(電壓門控鈉通道亞型—NaV1.5)、鈣通道(電壓依賴性L型鈣離子通道—CaV1.2、T型鈣通道—CaV3.2)以及多種鉀通道(心肌細(xì)胞超快延遲整流鉀通道(ultra-rapid delayed rectifier potassium channel，IKur，KV1.5)、瞬時(shí)外向鉀通道(transient outward potassium channel，Ito，KV4.3)、內(nèi)向整流鉀通道(inward rectifier potassium channel，Kir2.1)、ATP敏感性鉀通道(ATP sensitive potassium channel，KATP)、鈣通道3.2亞型(calcium channel subtype 3.2，T-type，Cav3.2)、乙酰膽堿敏感性鉀通道(acetylcholine-sensitive potassium channel，KAch)等。心臟動(dòng)作電位的產(chǎn)生是心臟離子通道順序活動(dòng)產(chǎn)生的結(jié)果，因此，調(diào)節(jié)心臟離子通道的活動(dòng)，是多數(shù)抗心律失常藥物最主要的作用機(jī)理。本研究利用膜片鉗技術(shù)，發(fā)現(xiàn)調(diào)脈飲對(duì)hERG (IKr)鉀通道、NCX鈉鈣交換電流具有明顯的抑制作用；對(duì)ATP敏感鉀電流、CaV3.2鈣電流和HCN4竇房結(jié)起搏電流具有中度的抑制作用；同時(shí)可以增加緩慢延遲復(fù)極鉀電流IKs (KV7.1)。課題組推測(cè)調(diào)脈飲抗心律失常主要通過抑制Na-Ca交換蛋白(NCX)和抑制hERG通道發(fā)揮作用。由于其抑制hERG電流的同時(shí)顯著增加IKs電流，IKs電流的增加可能抵消抑制hERG通道引起的過度動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)和QT間期延長(zhǎng)。因此，從作用機(jī)制上，相對(duì)于一般的III類抗心律失常藥物(鉀通道阻斷劑)，調(diào)脈飲可能具有更好的安全性。由于其抑制CaV3.2電流和HCN4電流，可能引起心率降低，對(duì)心力衰竭患者可能有幫助作用。另外，調(diào)脈飲對(duì)KATP的抑制作用，可能還具有心肌缺血的保護(hù)作用。本研究中觀察調(diào)脈飲對(duì)IPSC-CM動(dòng)作電位的直接作用，結(jié)果顯示調(diào)脈飲顆?？梢鹦募?dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)，延長(zhǎng)心臟有效不應(yīng)期，從而產(chǎn)生抗心律失常效應(yīng)。

本研究中應(yīng)用的人源性干細(xì)胞誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞(IPSC-CM)研究，是評(píng)價(jià)藥物對(duì)心肌細(xì)胞作用的新技術(shù)，其特點(diǎn)是人源性細(xì)胞，沒有種屬差異，因此更加能夠預(yù)測(cè)藥物對(duì)心律失常的作用；同時(shí)IPSC-CM比較容易獲得，不受細(xì)胞來源限制，因此正在被廣泛的用于心臟藥物篩選及早期心臟復(fù)極毒性評(píng)價(jià)[13]。結(jié)果提示，1mg/L調(diào)脈飲顆粒顯著延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程APD30、APD50和APD90。延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程和動(dòng)作電位有效不應(yīng)期，是很多III類抗心律失常藥物如多菲利特、胺碘酮等的主要作用機(jī)理，也可能是調(diào)脈飲發(fā)揮抗心律失常作用的機(jī)制。但是，III類抗心律失常藥物如多菲利特，由于強(qiáng)烈抑制hERG通道，因此同時(shí)具有較強(qiáng)的致QT延長(zhǎng)及尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動(dòng)過速的風(fēng)險(xiǎn)。而調(diào)脈飲顆粒是通過多離子通道靶點(diǎn)發(fā)揮作用，其抑制hERG通道的同時(shí)，增加緩慢延遲復(fù)極鉀電流(KV7.1)，從而可能抵消hERG通道引起的尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動(dòng)過速的風(fēng)險(xiǎn)。

總之，傳統(tǒng)方劑抗心律失常的靶點(diǎn)和機(jī)理發(fā)現(xiàn)，一直是一個(gè)研究難題。本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)脈飲延長(zhǎng)IPSC-CM動(dòng)作電位時(shí)程和對(duì)NCX、hERG通道電流的抑制作用可能是其抗心律失常作用的主要機(jī)制，抑制CaV3.2鈣電流和HCN4竇房結(jié)起搏電流，可能引起降低心率的作用，增強(qiáng)KV7.1電流可能抵消抑制hERG通道引起的過度動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)和QT間期延長(zhǎng)，其對(duì)KATP的抑制作用可能起到心肌缺血的保護(hù)作用。本研究進(jìn)一步證明了調(diào)脈飲是通過抑制心肌多種離子通道，延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程，延長(zhǎng)有效不應(yīng)期，從而發(fā)揮抗心律失常作用，為調(diào)脈飲的抗心律失常作用和臨床應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。