韓 冬，溫璐璐，王 玨，高 巖，馮 娟

卒中是導(dǎo)致成年人死亡及長(zhǎng)期殘疾的主要原因，其中缺血性卒中占絕大多數(shù)[1]。缺血性卒中是由血栓或栓塞阻塞大腦主要?jiǎng)用}造成的，導(dǎo)致局部血流阻斷隨后組織壞死。腦缺血再灌注損傷通常伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷，進(jìn)一步造成神經(jīng)障礙和記憶障礙。人尿激肽原酶是自人尿液中提取得到的蛋白水解酶，是目前應(yīng)用于臨床治療腦梗死I類新藥，具有舒張血管，抑制血小板聚集等功能[2]。本論文主要研究人尿激肽原酶調(diào)控nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3(NLRP3)炎性小體改善小鼠腦缺血/再灌注損傷的作用及初步機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性成年C57BL/6小鼠(22～25 g)，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0001。人尿激肽原酶(Human Urinary Kallindinogenase，UK)購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司(規(guī)格：0.15PNA單位/瓶，批號(hào)：311711021，商品名：尤瑞克林)。小鼠IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、real time PCR擴(kuò)增試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；NLRP3、ASC抗體購自愛博泰克生物科技有限公司；Casepase-1抗體購自abcam公司。

1.2 動(dòng)物分組及給藥 雄性C57/BL6小鼠60只，于造模前隨機(jī)分為4組，分別為假手術(shù)組(Sham)，模型組(MCAO/R)，人尿激肽原酶高劑量組(UK-H，35×10-3PNAU/kg)、人尿激肽原酶低劑量組(UK-L，17.5×10-3PNAU/kg)。各組分別于復(fù)灌后0.5 h靜脈給藥，給藥容積0.1 ml/10 g，假手術(shù)組與模型組分別靜脈給予生理鹽水溶液。

1.3 模型制備 線栓法制備小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注(MCAO/R)模型[3]：將小鼠用2%水合氯醛腹腔注射(i. p)麻醉后，解剖分離暴露頸部血管，于頸外動(dòng)脈主干剪一小口，將硅膠直徑為(0.22±0.01)mm的特制線栓由剪口向頸內(nèi)動(dòng)脈入顱方向慢慢插入，至頸總動(dòng)脈分支約10 mm左右時(shí)稍有阻力，阻斷了大腦中動(dòng)脈的血流供應(yīng)。1 h后，拔出線栓，完成復(fù)灌。假手術(shù)組的小鼠麻醉后，如其他組一般分離暴露血管，但不使用線栓堵塞大腦中動(dòng)脈。

1.4 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及腦梗死面積測(cè)定 小鼠于MCAO/R后24 h，按Bederson報(bào)道方法[4]對(duì)動(dòng)物的神經(jīng)功能缺陷進(jìn)行分級(jí)評(píng)分。脫頸處死后取出全腦，做冠狀切片，每片厚度為2 mm。1%TTC染色，數(shù)碼相機(jī)拍照，ImageJ軟件進(jìn)行分析，計(jì)算梗死面積如下：梗死面積(%)=(缺血對(duì)側(cè)面積-缺血側(cè)正常面積)/缺血對(duì)側(cè)面積×100%

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)缺血腦組織和血清中炎癥因子釋放 小鼠于MCAO/R后24 h，摘眼球取血，室溫血液自然凝固20 min，4℃ 2500 r/min離心20 min，取上清。脫頸處死后取腦，分離缺血側(cè)半腦，按質(zhì)量體積比1∶10的量加入預(yù)冷PBS，冰上勻漿，4 ℃ 2500 r/min離心20 min，取上清。根據(jù)不同ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行操作，分別檢測(cè)血清和腦組織中的IL-1β、IL-18。

1.6 Real Time PCR、Western blot法檢測(cè)NLRP3炎癥小體mRNA及蛋白表達(dá) 小鼠于MCAO/R后24 h，脫頸處死后取腦，分離缺血側(cè)半腦。Real time PCR：Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄參照試劑盒說明書操作，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。引物序列如下：NLRP3 forward：ATGCTGCTTCGACATCTCCT，reverse：AACCAATGCGAGATCCTGAC；ASC forward：GAAGCTGCTGACAGTGCAAC，reverse：GCCACAGCTCCAGACTCTTC；caspase-1 forward：AGATGGCACATTTCCAGGAC，reverse：GATCCTCCAGCAGCAACTTC；β-actin forward：AGAGGGAAATCGTGCGTGAC，reverse：CAATAGTGATGACCTGGCCGT。以β-actin作為內(nèi)參基因，2-△△CT計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

Western blot：收集腦組織勻漿，RIPA裂解細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白含量，煮沸變性，-80 ℃保存。凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉-TBST溶液封閉非特異性蛋白，加一抗4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育90 min，ECL發(fā)光液顯色，曝光成像，ImageJ軟件分析照片。

2 結(jié) 果

2.1 尤瑞克林降低腦缺血再灌注小鼠腦梗死面積 由圖1可見，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠的腦梗死率顯著性升高(P<0.01)。與模型組比較，人尿激肽原酶高、低劑量組均能極顯著降低MCAO/R后小鼠腦梗死面積(P<0.01)。

(A) TTC染色各組代表圖片 ；(B) 腦梗死面積柱狀圖；與假手術(shù)組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

2.2 人尿激肽原酶改善腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)行為學(xué)損傷 由圖2可見，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分極顯著性升高(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，人尿激肽原酶高劑量組能極顯著降低MCAO/R后小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(P<0.01)。

與假手術(shù)組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

2.3 人尿激肽原酶抑制腦缺血再灌注小鼠血清和腦組織中IL-1β和IL-18表達(dá) 由圖3可見，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清和腦組織中IL-1β和IL-18含量極顯著性升高(P<0.01)。與模型組比較，人尿激肽原酶高、低劑量組均能不同程度降低小鼠血清中和腦組織中IL-1β含量(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，人尿激肽原酶高劑量組能顯著降低小鼠血清中和腦組織中IL-18含量(P<0.05)。

2.4 人尿激肽原酶下調(diào)腦缺血再灌注小鼠腦組織NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA表達(dá) 由圖4可見，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織中NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA含量顯著性升高(P<0.05)。與模型組比較，人尿激肽原酶高、低劑量組均能顯著降低小鼠腦組織中NLRP3和ASC mRNA含量(P<0.05)；與模型組比較，人尿激肽原酶高劑量組能顯著降低小鼠腦組織中caspase-1 mRNA含量(P<0.05)。

2.5 人尿激肽原酶抑制缺血再灌注小鼠腦組織NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá) 由圖5可見，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá)水平不同程度升高(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，人尿激肽原酶高劑量組能極顯著降低小鼠腦組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平(P<0.01)；與模型組比較，人尿激肽原酶高劑量組能顯著降低小鼠腦組織中ASC和caspase-1蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。

與假手術(shù)組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

與假手術(shù)組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

與假手術(shù)組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

人尿激肽原酶能夠促進(jìn)激肽原中具有血管活性激肽的釋放，選擇性擴(kuò)張腦組織小動(dòng)脈，增加缺血腦組織的血流量[5]，改善神經(jīng)功能缺失。目前已證實(shí)缺血性卒中患者應(yīng)用人尿激肽原酶的臨床療效[6]，改善缺血腦組織血流灌注[7]。本文主要研究其對(duì)小鼠腦缺血/再灌注損傷的治療作用及其可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人尿激肽原酶治療給藥可顯著減輕小鼠腦缺血/再灌注損傷后的梗死面積及其神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，顯示了較好的抗腦缺血作用。

腦缺血再灌注后，缺血腦組織內(nèi)有大量炎癥因子產(chǎn)生，以及炎癥細(xì)胞的激活、浸潤(rùn)，繼而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)加重腦組織損傷，使腦組織由缺血性損傷轉(zhuǎn)向炎癥性損傷，炎癥反應(yīng)在腦缺血損傷中起重要作用[8，9]。而炎癥小體是炎癥免疫反應(yīng)的核心，目前研究最多的是NLRP3炎癥小體。NLRP3炎性小體是屬于NLRs家族中重要成員之一的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的多蛋白復(fù)合體，可以識(shí)別多種病原體相關(guān)的分子模式(PAMPs)。在受到刺激后可發(fā)生寡聚化反應(yīng)，N-末端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域用于募集ASC以活化caspase-1前體，進(jìn)而可水解切割pro-IL-1β、pro-IL-18為成熟形式的IL-1β、IL-18，釋放到細(xì)胞外參與局部或全身炎癥反應(yīng)[10]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人缺血腦組織當(dāng)中NLRP3小體蛋白以及IL-1β、IL-18表達(dá)量均升高[11]，而給予NLRP3拮抗劑能夠起到神經(jīng)保護(hù)作用[12]。因此，NLRP3是治療腦缺血/再灌注損傷藥物研究的重要靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，小鼠腦缺血/再灌注損傷后，NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)一步介導(dǎo)血清及腦組織中IL-1β、IL-18表達(dá)增加，加劇腦缺血后炎癥反應(yīng)。人尿激肽原酶治療給藥可顯著抑制IL-1β、IL-18表達(dá)，下調(diào)NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道，人尿激肽原酶在缺血性腦損傷中具有抗炎作用[13，14]，但是人尿激肽原酶通過干預(yù)NLPR3炎癥小體來抑制炎癥反應(yīng)尚未見報(bào)道。

因此，人尿激肽原酶可能通過抑制小鼠腦缺血/再灌注后NLRP3炎性小體表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)，減輕腦缺血損傷。在以后的工作中，我們還將繼續(xù)通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、NLRP3敲除小鼠及應(yīng)用NLRP3特異性拮抗劑等方法進(jìn)一步研究人尿激肽原酶抗腦缺血損傷的靶細(xì)胞及其分子機(jī)制。