莫智媛 婁 俊

(1 桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦科，廣西桂林市 541199，電子郵箱：sion804@163.com；2 江西省腫瘤醫(yī)院婦科，南昌市 330029)

宮頸癌為婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，研究表明，我國(guó)宮頸癌患者的發(fā)病率及死亡率較高，已成為國(guó)內(nèi)癌癥死亡的常見(jiàn)病因[1-2]。因此，探究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，明確其診療靶標(biāo)具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的不編碼蛋白質(zhì)的RNA，其可在表觀遺傳學(xué)、基因組轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層面上調(diào)控基因的表達(dá)[3-4]。有研究顯示，lncRNA可通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、抵抗凋亡、逃避生長(zhǎng)抑制因子及促進(jìn)血管生成等參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程[5]。本研究探討lncRNA LINC00460在宮頸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月至2018年12月桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院和江西省腫瘤醫(yī)院收治的100例宮頸癌患者作為研究對(duì)象。年齡38～81(59.63±9.59)歲，均符合宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：入組患者均接受手術(shù)治療，均為首次發(fā)病，且術(shù)前均未行任何放療、化療等輔助治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肝腎功能?chē)?yán)重障礙、凝血功能異常、既往有腫瘤病史等病例。于術(shù)后30 min內(nèi)采集宮頸癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織(距癌組織邊緣≥2 cm)后立即經(jīng)液氮冷凍處理，并置于-80℃冰箱中保存待用(本研究收集的樣本組織均于2019年2～3月統(tǒng)一進(jìn)行檢測(cè))。所有癌旁組織樣本均經(jīng)病理證實(shí)為正常宮頸組織。本研究通過(guò)桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院和江西省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，入組對(duì)象均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑與儀器 RNA提取試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：061205-4)由美國(guó)Roche公司生產(chǎn)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：6A11302、6H12173)由日本TaKaRa公司生產(chǎn)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)：7500型)購(gòu)自美國(guó)ABI公司；-80℃超低溫冰箱(型號(hào)：VXE90型)購(gòu)自法國(guó)Jouan公司；紫外分光光度計(jì)(型號(hào)：Evolution 201)購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；lncRNA LINC00460引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 提取總RNA：從液氮罐中取出組織標(biāo)本，剪取100 mg組織標(biāo)本超聲勻漿，提取組織中總RNA，嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。經(jīng)二乙基焦磷酰胺水溶解后檢測(cè)RNA完整性，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度及濃度。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：反應(yīng)體系為20 μL，嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，冰上依次加入：總RNA 1 μL、1 μmol/L反轉(zhuǎn)錄特異性引物3 μL、20 U/μL RNA酶抑制劑0.19 μL、50 U/μL反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL、100 mmol/L寡核苷酸0.15 μL、10倍的緩沖液1.5 μL，加不含RNase 的水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：16℃ 15 min，42℃ 60 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min，產(chǎn)物置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系為20 μL，嚴(yán)格按照PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，冰上依次加入以下試劑：cDNA 1 μL、引物1 μL、混合液10 μL，加雙蒸水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 15 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3.4 結(jié)果分析：采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA LINC00460的表達(dá)水平，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，每組取3個(gè)復(fù)孔均值，根據(jù)各樣本的平均Ct值，以2-ΔΔCt表示lncRNA LINC00460相對(duì)表達(dá)水平，lncRNA LINC00460相對(duì)表達(dá)量Δ2-ΔΔCt值=lncRNA LINC00460的2-ΔΔCt值-β-肌動(dòng)蛋白的2-ΔΔCt值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t或t′檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌組織及癌旁正常組織中l(wèi)ncRNA LINC00460的表達(dá)水平對(duì)比 宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA LINC00460的相對(duì)表達(dá)量為(7.38±1.92)，高于癌旁正常組織的(1.65±0.88)(t′=27.130，P<0.001)。

2.2 宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA LINC00460的表達(dá)水平與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 低分化程度、高原發(fā)腫瘤-區(qū)域淋巴結(jié)-遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(tumor-node-metastasis，TNM)分期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA LINC00460的相對(duì)表達(dá)量均較高分化程度、低TNM分期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移者升高(均P<0.05)；而不同年齡、病理分型、腫瘤直徑及是否絕經(jīng)的宮頸癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA LINC00460的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA LINC00460的表達(dá)水平與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系(x±s)

3 討 論

lncRNA是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)編碼RNA，具有豐富的生物學(xué)功能，其可在表觀遺傳學(xué)、基因組轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層面上調(diào)控基因的表達(dá)[7-8]。近年來(lái)，lncRNA與疾病的關(guān)系引起了廣泛關(guān)注。目前已在腫瘤組織中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些異常表達(dá)的lncRNA，涉及各個(gè)系統(tǒng)的腫瘤[9]。有研究顯示，lncRNA是通過(guò)與RNA結(jié)合蛋白形成復(fù)合物的方式調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因或癌基因的功能，其可通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、抵抗凋亡、逃避生長(zhǎng)抑制因子及促進(jìn)血管生成等方式參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10-11]。

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，近年來(lái)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)宮頸癌患者的發(fā)病率逐年增加，且呈年輕化趨勢(shì)[12]。有研究顯示，宮頸癌患者經(jīng)外科手術(shù)和化療后的復(fù)發(fā)率較高，患者預(yù)后較差[13]。因此，尋找新的研究方向，進(jìn)一步探討宮頸癌的分子生物學(xué)特點(diǎn)及發(fā)病機(jī)制，對(duì)明確其診療靶標(biāo)具有重要意義，而近年來(lái)引起廣泛關(guān)注的lncRNA可能是突破口之一。近年來(lái)，在宮頸癌中新發(fā)現(xiàn)多種lncRNA[14-15]，但目前這些lncRNA與宮頸癌的關(guān)系尚未明確。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA LINC00460的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常組織(P<0.05)，提示lncRNA LINC00460在宮頸癌組織中呈高表達(dá)。進(jìn)一步分析lncRNA LINC00460的表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，不同年齡、病理分型、腫瘤直徑、是否絕經(jīng)的宮頸癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA LINC00460的相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，而分化程度越低、TNM分期越高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者lncRNA LINC00460的表達(dá)水平越高(均P<0.05)，即惡性程度高的患者，lncRNA LINC00460表達(dá)升高，提示lncRNA LINC00460的高表達(dá)可能參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，由此推斷下調(diào)lncRNA LINC00460的表達(dá)，可能是臨床治療宮頸癌的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，lncRNA LINC00460在宮頸癌組織中呈高表達(dá)，這可能與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。