梁秀俊，馮 碩，衛(wèi) 敏，衛(wèi) 偉

(1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.東南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南京 211189)

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，多產(chǎn)生于糧食谷物的生長、運輸及儲藏過程中并對其造成嚴重的污染[1]。真菌毒素具有較強的致癌作用、致畸作用、遺傳毒性、免疫毒性和細胞毒性，可損害肝臟、腎臟、神經(jīng)組織、造血組織及皮膚組織等，對食品安全及人體健康造成嚴重威脅[2-3]。此外，多種真菌毒素同時存在產(chǎn)生的加成效應(yīng)使其毒性增強，已經(jīng)引起世界各國的關(guān)注[4-6]。作為常見的真菌毒素，赭曲霉毒素 A(OTA)和伏馬菌素 B1(FB1)可能共存于玉米、小麥、啤酒和飼料等農(nóng)作物及其制品中，通過食物鏈對人類健康造成危害。因此，建立靈敏、快速、經(jīng)濟且準確的 OTA 和 FB1同時檢測方法具有重要意義。

在目前的真菌毒素檢測方法中，電化學(xué)核酸適配體傳感器因操作簡便、選擇性高、儀器小型、易于實現(xiàn)現(xiàn)場檢測等優(yōu)勢而成為研究熱點[7-8]。由于OTA和FB1的存在多為痕量級，借助納米材料實現(xiàn)信號放大以提高電化學(xué)核酸適配體傳感器的靈敏度受到廣泛關(guān)注。石墨烯(GR)具有生物相容性好、導(dǎo)電性強、比表面積大、能夠通過π-π相互作用吸附單鏈DNA等優(yōu)點，被用于電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建[9-10]。另一方面，金納米棒(AuNRs)因?qū)щ娦詮?、生物相容性好、對巰基修飾的物質(zhì)具有高吸附能力等優(yōu)點而被廣泛用于信號放大策略的設(shè)計[11-12]。

本文中，筆者制備AuNRs作為核酸適配體和信號探針的固定載體，利用GR修飾電極吸附單鏈DNA，構(gòu)建新型電化學(xué)核酸適配體傳感器用于OTA和FB1的同時檢測研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

OTA的核酸適配體(Apt1)5′-SH-G￣A￣T￣C￣G￣G￣G￣T￣G￣T￣G￣G￣G￣T￣G￣G￣C￣G￣T￣A￣A￣A￣G￣G￣G￣A￣G￣C￣A￣T￣C￣G￣G￣A￣C￣A-3′和FB1的核酸適配體(Apt2)5′-SH-A￣T￣A￣C￣C￣A￣G￣C￣T￣T￣A￣T￣T￣C￣A￣A￣T￣T￣A￣A￣T￣C￣G￣C￣A￣T￣T￣A￣C￣C￣T￣T￣A￣T￣A￣C￣C￣A￣G￣C￣T￣T￣A￣T￣T￣C￣A￣A￣T￣T￣A￣C￣G￣T￣C￣T￣G￣C￣A￣C￣A￣T￣A￣C￣C￣A￣G￣C￣T￣T￣A￣T￣T￣C￣A￣A￣G￣T￣A￣G￣A￣T￣A￣G￣T￣A￣A￣G￣T￣G￣C￣A￣A￣T￣C￣T-3′，生物工程(上海)股份有限公司；OTA、FB1、黃曲霉毒素B1(AFB1)和玉米赤霉烯酮(ZEA)，Sigma-Aldrich公司；巰基二茂鐵(Fc-SH)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫堇(Th)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；石墨烯，鄭州時代納米生物技術(shù)有限公司；其余所使用的化學(xué)試劑均為市售分析純。

CHI 660E型電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司。交流阻抗參數(shù)設(shè)置：電位0.19 V，掃描速率5 mV/s，掃描范圍0.1 Hz～10 kHz。差分脈沖參數(shù)設(shè)置：掃描區(qū)間-0.4～0.6 V，掃描速率50 mV/s。所制備材料用掃描電子顯微鏡(JSM-7610F，日本電子株式會社)進行表征。

1.2 方法

1.2.1 Apt1-AuNRs-Th和Apt2-AuNRs-Fc的制備

將5 mg/mL Th和0.1 mol/L Fc-SH加至制備好的AuNRs溶液中振蕩2 h，離心后分別加入2 μmol/L Apt1和Apt2，繼續(xù)振蕩孵育2 h。離心后加入0.5% 牛血清白蛋白(BSA)振蕩孵育40 min。離心后加入適量的Tris-HCl緩沖液得到Apt1-AuNRs-Th和Apt2-AuNRs-Fc。

1.2.2 Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE傳感器制備

在清洗、活化過的金電極(AuE)表面滴加5 μL配制好的石墨烯-殼聚糖(GR-CS)溶液，得到GR-CS/AuE。滴加5 μL BSA至電極表面，37 ℃孵育1 h后用 Tris-HCl緩沖液洗去多余的BSA。然后滴加5 μL Apt1-AuNRs-Th和Apt2-AuNRs-Fc至電極表面，37 ℃孵育2 h后用Tris-HCl緩沖液沖洗，得到Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE傳感器。

圖1為Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE傳感器檢測原理圖。當毒素不存在時，GR和AuNRs雙重信號放大作用使得電極表面信號探針Th和Fc產(chǎn)生大的電流信號；當毒素存在時，Apt與其對應(yīng)的毒素形成復(fù)合物并從電極表面脫落，電極表面的Th和Fc減少，對應(yīng)的電流信號降低。依據(jù)加入毒素前后產(chǎn)生的電流變化，可以實現(xiàn)對OTA和FB1的同時檢測。

圖1 基于Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE傳感器的檢測原理

2 結(jié)果與討論

2.1 Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE傳感器表征

利用掃描電鏡(SEM)對GR和Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR進行形貌表征的結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，GR的薄層狀結(jié)構(gòu)清晰明顯(圖2(a))，表面存在褶皺；而當AuNRs成功被GR吸附，則在GR的表面出現(xiàn)大量點狀物(圖2(b))。

圖2 GR和Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR的掃描電鏡

用交流阻抗對傳感器的制備過程進行表征，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：AuE(a)和GR-CS/AuE(b)的阻抗值分別為136.2和40.1 Ω，說明GR良好的導(dǎo)電性能促進了電極表面的電子轉(zhuǎn)移；BSA封閉GR-CS/AuE(c)的阻抗值增大至104 Ω。先后加入Apt1-AuNRs-Th和Apt2-AuNRs-Fc，雖然電極表面負載的AuNRs具有較好的促進電子轉(zhuǎn)移能力，但是單鏈DNA會排斥帶負電荷的[Fe(CN)6]3-/4-。因此，Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE(d)和Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE(e)的阻抗值分別增至247.4和368.3 Ω。圖2和圖3的結(jié)果表明，Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE傳感器制備成功。

圖3 不同電極在5 mmol/L K3[Fe(CN)6](含0.10 mol/L KCl)溶液中的交流阻抗

2.2 Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE傳感器同時檢測OTA和FB1

圖4為Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE傳感器同時檢測在50 mmol/L 的Tris-HCl溶液中的OTA和FB1的差分脈沖曲線。

圖4 Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE傳感器孵育 0.1 ng/mL OTA和FB1前(a)、后(b)在50 mmol/L 的Tris-HCl溶液中的差分脈沖曲線

由圖4可知：未加入OTA和FB1(a)時，Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE傳感器上Th和Fc產(chǎn)生的峰電流值分別為299.3和314.8 μ??；當加入0.1 ng/mL OTA和FB1(b)后，Th和Fc產(chǎn)生的峰電流值分別降低至184.5和186.1 μΑ，推斷是因為OTA和FB1與其對應(yīng)的Apt結(jié)合，使Apt的構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致Apt1-AuNRs-Th和Apt2-AuNRs-Fc從電極上脫落，電極表面信號探針Th和Fc減少。Th和Fc產(chǎn)生的峰電流變化與加入目標物的量相關(guān)，從而實現(xiàn)OTA和FB1的同時檢測。

進一步研究OTA和FB1加入前后Th和Fc峰電流變化(ΔI)與濃度的對應(yīng)關(guān)系，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同濃度OTA和FB1對應(yīng)的差分脈沖曲線(a)及其與ΔI的關(guān)系(b)

由圖5可知，隨著OTA和FB1濃度增大，Th和Fc對應(yīng)的ΔI也逐漸增大。在5×10-4～1×103ng/mL范圍內(nèi)，Th和Fc的峰電流值與lg C呈線性相關(guān)(圖5(b))，線性方程分別為ΔI1=31.22 lgCOTA+144.08(R2=0.998)和ΔI2=34.02 lgCFB1+162.72(R2=0.998)，OTA和FB1檢出限分別為 0.34和0.17 pg/mL。所制備傳感器的檢出限與文獻報道的電化學(xué)傳感器比較如表1所示。

由表1可知，制備的傳感器具有較寬的線性范圍和較低的檢出限。與文獻[12]相比，該傳感器可以省去作為固定核酸適配體載體的互補鏈，不僅能夠節(jié)約實驗材料、降低實驗成本，還可以減少傳感器的制備時間。

表1 不同電化學(xué)傳感器檢測OTA及FB1的結(jié)果比較

2.3 Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE傳感器性能

考察傳感器對AFB1和ZEA的抗干擾性能，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同毒素對傳感器特異性的影響(OTA和 FB1：0.1 ng/mL；ZEA 和AFB1：5 ng/mL)

由圖6可以看出，只有當OTA和FB1分別單獨存在時，Th和Fc的峰電流明顯降低，說明該傳感器具有良好的特異性。

對相同條件下制備的5個傳感器進行測定，得到Th和Fc峰電流的相對標準偏差(RSD)分別為6.47%和7.18%，說明制備的傳感器具有可接受的重現(xiàn)性。對同一傳感器進行5次重復(fù)測量，Th和Fc峰電流的RSD分別為5.19%和6.41%，說明制備的傳感器具有可接受的重復(fù)性。

2.4 實際樣品檢測結(jié)果

對啤酒樣品進行N2吹除去其泡沫后，加入適量OTA和FB1的標準母液，并用Tris-HCl緩沖液稀釋，使OTA和FB1的3個梯度質(zhì)量濃度分別為1×10-3、1.0和500 ng/mL。利用制備的傳感器對加標啤酒進行檢測，結(jié)果見表2。

表2 啤酒樣品中OTA和FB1的檢測(n=3)

由表2可知，OTA和FB1的平均回收率為 94.1%～97.7%和 87.1%～95.3%，表明該傳感器可用于實際樣品的檢測。

3 結(jié)論

利用GR制備新型Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE傳感器用于OTA和FB1的同時檢測，得到檢出限分別為0.34和0.17 pg/mL。該傳感器具有良好的特異性、較好的重復(fù)性和重現(xiàn)性、可接受的樣品檢測回收率，為進一步開發(fā)靈敏度高、選擇性好、用于現(xiàn)場檢測真菌毒素的方法奠定了基礎(chǔ)，可作為保障我國食品安全的一種有效的技術(shù)手段。