杜 剛，詹夢(mèng)濤，馬堅(jiān)司毅，普瓊梅，王 萌，楊海英*

（1.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500；2.云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南昆明 650500）

蜂蜜是昆蟲蜜蜂從開(kāi)花植物的花中采得的花蜜在蜂巢中釀制的蜜，其主要成分為單糖（葡萄糖、果糖）（占總糖的85%～95%），還含有豐富的酶、礦質(zhì)元素、維生素、氨基酸等[1-2]，稀釋的蜂蜜經(jīng)酵母菌發(fā)酵可制成具有保健作用的蜂蜜酒[3-5]。蜂蜜酒需要較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵，可能在最終產(chǎn)品中引入令人不快的氣味[6-7]。蜂蜜酒的發(fā)酵過(guò)程若蜜汁的濃度過(guò)低，酵母菌會(huì)因碳源不足衰老自溶[8]，而高濃度的蜜汁有較高的滲透壓，要求用于發(fā)酵的酵母需適應(yīng)蜂蜜的抑菌和高滲環(huán)境。目前國(guó)內(nèi)售的蜂蜜酒多為蜂蜜與酒勾兌而成，缺乏適用于蜂蜜酒發(fā)酵的菌株，篩選合適的菌株成為蜂蜜酒研制的關(guān)鍵問(wèn)題。通常從高糖環(huán)境中篩選耐高糖酵母[9]，研究表明原生的蜂蜜中含有耐高滲酵母菌及其他微生物[10-13]，但鮮見(jiàn)從蜂蜜中分離菌株發(fā)酵蜂蜜酒的報(bào)道。云南野生蜂蜜資源豐富，本研究從云南文山的蜂蜜樣品中分離酵母菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定和基因間隔序列（internal transcript space，ITS）分析進(jìn)行菌種鑒定，經(jīng)過(guò)感官評(píng)價(jià)篩選性能較優(yōu)的酵母，并將其應(yīng)用于蜂蜜酒研制，采用同時(shí)蒸餾萃?。╯imultaneous distillation extraction，SDE）-氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）方法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行揮發(fā)性成分分析[14-15]，旨在為蜂蜜酒的開(kāi)發(fā)提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

采自云南文山的12份蜂蜜樣品（編號(hào)1～12號(hào)）。

1.1.2 試劑

真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；FTC-3000P型聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：加拿大Funglyn Biotech公司；二氯甲烷、NaCl、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉（均為分析純或生化試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YPD）固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L，酵母膏10 g/L，pH 自然，121 ℃滅菌25min。

蜂蜜稀釋液：蜂蜜與水按3∶7的體積比進(jìn)行混合，75 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWT-2012 恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；LRH-250-G恒溫干燥培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2PD超凈工作臺(tái)：蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；YXQLS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；THERMOFISHER（ISQ）氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀、TR-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細(xì)管色譜柱：美國(guó)賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Scout SE電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；共同蒸餾萃取裝置（定制）；HH-S2電熱恒溫水浴鍋：江蘇大地自動(dòng)化儀器廠；GelDoc EZ型凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離純化

取1 g 蜂蜜樣品，加入9 mL無(wú)菌生理鹽水中，混勻后進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取適宜的濃度梯度，用涂布法接種于YPD 固體培養(yǎng)基，32 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h，挑取具有典型酵母菌形態(tài)特征的菌落，平板劃線純化，直至獲得純培養(yǎng)菌株。挑取單菌落轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD 斜面，于32 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，裝入密封袋置于4 ℃冰箱保藏。

1.3.2 酵母菌的鑒定

（1）菌株的形態(tài)特征

采用劃線法接種少量已純化好的菌種于YPD平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落干濕、隆起、顏色、菌落邊緣、表面光澤、質(zhì)地等形態(tài)特征，選取單個(gè)菌落制成裝片光學(xué)顯微鏡高倍下觀察記錄細(xì)胞形態(tài)。

（2）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增和DNA 測(cè)序

以平板劃線法對(duì)保存斜面菌種活化驗(yàn)純，挑取單菌落接種于YPD試管斜面作為種子，將每只試管種子接種于裝液量為150 mL/250 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)5 d，再次驗(yàn)純，培養(yǎng)物13 000 r/min 離心10 min，收集菌體。參照說(shuō)明書，使用真菌基因組DNA提取試劑盒提取高質(zhì)量的菌體基因組DNA。采用酵母菌通用引物ITS1F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'和ITS4B：5'-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3'對(duì)5.8S rDNA-ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增[16]。25μLPCR反應(yīng)體系為：2×PowerTaqPCRMasterMix12.5μL，引物各2 μL，模板2 μL，加無(wú)酶水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)熱3 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃終延伸5 min，30 個(gè)循環(huán)后72 ℃末端延伸10 min，4 ℃保存[17]。切下500～750 bp左右的目標(biāo)片段，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收。PCR回收產(chǎn)物的測(cè)序工作由昆明碩擎測(cè)序公司完成。

1.3.3 ITS序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

從GeneBank中獲取Z.siamensis、Z.mellis、Z.pseudorouxii、Z.rouxii和Z.sapae等菌株的ITS序列。在MEGA-X[18]中使用MUSCLE[19]進(jìn)行多序列比對(duì)，并采用鄰接（neighbour-joining，NJ）法[20]以1 000次bootstrap[21]推測(cè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 蜂蜜酒發(fā)酵酵母菌的篩選

將分離得到的菌株制備種子液，分別以5%的接種量接種到200 mL蜂蜜稀釋液中，每個(gè)菌株接種3瓶。28 ℃靜置培養(yǎng)30 d，制備蜂蜜酒。通過(guò)感官評(píng)價(jià)篩選出口感好、香味濃郁的發(fā)酵菌株。

1.3.5 蜂蜜酒揮發(fā)性成分分析

利用同時(shí)蒸餾萃取（SDE）-氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法對(duì)蜂蜜酒樣品中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，量取300 mL蜂蜜酒樣品置于500 mL樣品瓶，加入2.0 g NaCl，電熱套加熱樣品保持微沸，量取40 mL二氯甲烷置于溶劑瓶中，用60 ℃恒溫水浴加熱，蒸餾萃取2 h停止加熱。萃取溶劑中加入適量無(wú)水硫酸鈉靜置密封，置于冰箱中冰凍過(guò)夜，0.45 μm濾頭過(guò)濾后供GC-MS分析。

氣相色譜條件為TR-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為氦氣（He）；柱流量為0.5 mL/min；進(jìn)樣模式：分流模式（分流比為20∶1）。

程序升溫：起始溫度為40 ℃，保持3 min，以4 ℃/min的速率升至100 ℃保持3 min，以10 ℃/min的速率升溫至230 ℃保持8 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，倍增器電壓1 600 V。質(zhì)譜掃描范圍為10～500 amu，掃描方式：全掃描，掃描速度：0.2 scan/s。離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度：250 ℃。

定性定量分析：各組分通過(guò)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）11譜庫(kù)檢索進(jìn)行定性分析，采用面積歸一法進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離及形態(tài)特征

從第3、5、7、9和10號(hào)蜂蜜樣品中分別分離到Y(jié)3、Y5、Y7、Y9和Y10等5株菌，其形態(tài)觀察結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，5株菌的細(xì)胞形態(tài)相似，均呈橢圓，菌株Y3、Y5、Y9和Y10菌落特征相似，菌株Y7菌落較為扁平，其菌落及細(xì)胞形態(tài)如圖1所示，5株菌均呈現(xiàn)典型的酵母菌落特征，初步判定這5株菌為酵母菌。

表1 分離菌株菌落及細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果Table 1 Colony and cell morphology of isolated strains

圖1 菌株Y3的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)特征Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphological characteristics of strain Y3

2.2 分離菌株分子鑒定結(jié)果

2.2.1 分離菌株的PCR 結(jié)果

5株分離菌株的PCR 擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，5株菌的PCR產(chǎn)物片段大小在500～750 bp 之間，判斷為5株酵母菌的ITS序列擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2 分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增的結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of isolated strains

2.2.2 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

分離菌株5.8S rDNA-ITS序列相似性基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）查詢結(jié)果如表2所示，菌株Y3、Y5、Y9和Y10與菌株Zygosaccharomyces siamensisAB565769.1相似性在99%以上，菌株Y7與菌株Zygosaccharomyces siamensisAB565768.1相似性在99%以上。

表2 酵母5.8S rDNA-ITS序列相似性Blast查詢結(jié)果Table 2 Blast search results of 5.8S rDNA-ITS sequence similarity of isolated strains

分離菌株的ITS序列比對(duì)后，在MEGA-X中以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株Y3、Y5、Y9和Y10與Zygosaccharomyces siamensisAB565769.1聚為一簇，Y7與Zygosaccharomyces siamensisAB565768.1聚為一簇。初步鑒定5株酵母菌均為暹羅接合酵母（Zygosaccharomyces siamensis）。

圖3 分離菌株基于ITS基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of isolated strains based on ITS gene sequences

2.3 蜂蜜酒發(fā)酵酵母菌的篩選

以5株酵母菌發(fā)酵蜂蜜酒，其感官評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 酵母菌發(fā)酵蜂蜜酒的感官評(píng)價(jià)Table 3 Sensory evaluation of mead fermented with yeasts

由表3可知，發(fā)酵得到的蜂蜜酒都呈淡黃色，其中菌株Y7發(fā)酵的蜂蜜酒雜味較多，菌株Y3、Y5、Y9和Y10發(fā)酵蜂蜜酒的香型比較接近，都有獨(dú)特果香，其中以菌株Y3發(fā)酵的蜂蜜酒酒香和果香最為濃郁，發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生二氧化碳?xì)馀荩肟谖⒗?，口感清爽，菌株Y5、Y9和Y10的酒香和果香較淡，選擇菌株Y3進(jìn)行蜂蜜酒發(fā)酵進(jìn)一步研究。

2.4 蜂蜜酒發(fā)酵樣品揮發(fā)性成分分析

采用GC-MS對(duì)Y3發(fā)酵蜂蜜酒樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，其總離子流色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 蜂蜜酒樣品揮發(fā)性成分GC-MS分析總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of volatile components in the mead sample analysis by GC-MS

經(jīng)過(guò)NIST11譜庫(kù)檢索得到揮發(fā)性化合物的種類，計(jì)算相對(duì)含量結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，樣品共檢出41種揮發(fā)性成分，其中酯類14種，醇類7種，酸類2種、醛酮4種、烷烴12種。醇類物質(zhì)和酯類物質(zhì)是發(fā)酵樣品香氣的主要成分，醇類組分有2-甲基丙醇、苯乙醇、異戊醇等。其中，2-苯乙醇和異戊醇的相對(duì)含量分別為58.11%和25.43%；異戊醇具香蕉香味，刺舌頭，微澀。2-苯乙醇與玫瑰花香相似，微帶苦澀感。酯類物質(zhì)有4-羥基丁酸乙酰酯，3-甲基戊酸乙酯，乙酸戊酯，辛酸乙酯，這些酯類產(chǎn)生的香氣相互綜合，賦予發(fā)酵樣品濃郁的酯香。此外，在發(fā)酵樣品中檢測(cè)到酸類、醛類，含量低，可能對(duì)發(fā)酵樣品香氣的直接貢獻(xiàn)不大，但使發(fā)酵樣品的香氣更加飽滿。

表4 蜂蜜酒樣品揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果Table 4 Results of volatile components in the mead sample analysis by GC-MS

續(xù)表

3 結(jié)論

本研究從12份云南文山蜂蜜樣品中分離得到5株酵母菌，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)分析，鑒定5株酵母菌均為暹羅接合酵母（Zygosaccharomyces siamensis）。5株酵母菌都可發(fā)酵蜂蜜稀釋液，其中菌株Y3發(fā)酵的蜂蜜酒酒香和果香最為濃郁。以SDE-GC/MS方法分析菌株Y3發(fā)酵蜂蜜酒，蜂蜜酒樣品中含41種揮發(fā)性成分，2-苯乙醇和異戊醇相對(duì)含量達(dá)到58.11%和25.43%，是發(fā)酵液中主要的揮發(fā)性成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為蜂蜜酒開(kāi)發(fā)提供了菌株資源。