張亭妍，王宏雁，劉鐘棟

（河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南鄭州 450001）

在中國，饅頭成為人們的主食已經(jīng)流傳許久[1]，至今約有一千多年的時(shí)間。傳統(tǒng)老酵子作為發(fā)酵劑制作的饅頭一直受人們喜愛。老酵子是混合的發(fā)酵劑，里面含有大量的菌種，其中酵母菌起主要發(fā)酵作用，這些菌種能夠在面團(tuán)發(fā)酵時(shí)通過自身進(jìn)行酯化反應(yīng)等反應(yīng)，使面團(tuán)擁有獨(dú)特的風(fēng)味口感[2]。由于傳統(tǒng)老酵子多來自于民間農(nóng)家儲存方法，其中不乏含有一些雜菌影響?zhàn)z頭的風(fēng)味和口感[3]。因此，可將傳統(tǒng)老酵子中分離出的菌株進(jìn)行篩選，從而獲得發(fā)酵性能較強(qiáng)、產(chǎn)香性能高的酵母菌株。

在以往關(guān)于酵子發(fā)酵產(chǎn)香的菌種的研究中，付娜等[4]對篩選出的酵母菌菌株進(jìn)行分子鑒定和揮發(fā)性物質(zhì)分析；黨輝等[5]對從酵子饅頭中分離得到的3株酵母的發(fā)酵性能分析；馬榕燦等[6]對多種酵母的生長和對面團(tuán)發(fā)酵特性差異進(jìn)行研究。然而目前對分離篩選出產(chǎn)香性能高的酵母菌株應(yīng)用于饅頭生產(chǎn)工業(yè)中揮發(fā)性物質(zhì)成分的差異分析鮮有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究從傳統(tǒng)老酵子中篩選出活性和產(chǎn)香較好的酵母菌，對其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和生長條件優(yōu)化，利用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法對添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭和未添加產(chǎn)香酵母饅頭中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析，可作為提高工業(yè)生產(chǎn)饅頭風(fēng)味口感的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

傳統(tǒng)老酵子：河南省南陽市市售；高筋小麥面粉：河南龍騰面粉有限公司；活性干酵母：廣東梅山馬利酵母食品有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、瓊脂（均為生化試劑）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、DL2000 DNA Marker：天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶：廣東盛東科技有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）：北京智杰方遠(yuǎn)有限公司；生物染色液試劑：福建海標(biāo)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：蛋白胨8 g，酵母提取物4 g，葡萄糖8 g，蒸餾水400 mL。

YPD固體培養(yǎng)基：向YPD液體培養(yǎng)基中加入8 g瓊脂。將上述培養(yǎng)基放置在120 ℃滅菌25 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-X10型恒溫培養(yǎng)箱：紹興市景邁儀器設(shè)備有限公司；ABI9700聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：康力生物科技有限公司；THZ-24空氣浴恒溫?fù)u床：金壇區(qū)金城春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠；XSP-8C型電子顯微鏡：上海精密儀器儀表有限公司；ZF-388型全自動(dòng)凝膠成像分析儀：北京六一儀器廠；DYY-6C型電泳儀：河北聯(lián)潤設(shè)備有限公司；Implen OD600nm細(xì)菌/細(xì)胞濃度儀：北京盛科信德有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離純化

稱取0.3 g老酵子將其碾碎后，溶于無菌水中用滅菌玻璃棒攪勻20 min，使其基本溶解，加入200 mL YPD液體培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，取上述培養(yǎng)液的上清液2 mL將其稀釋104～106倍后取60 μL均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，當(dāng)平板上長出菌落時(shí)，挑取單菌落連續(xù)劃線傳代培養(yǎng)2～3次得到純化菌株。將得到的純菌株保菌，放于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 產(chǎn)香菌株篩選

初篩：取純化后的菌株以2%的接種量接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫180 r/min搖床培養(yǎng)1～2 d，同時(shí)將其劃線接種于YPD固體培養(yǎng)基上在28 ℃條件下培養(yǎng)1～2 d，采用嗅聞法，參考王益姝[7]的方法，通過嗅聞發(fā)酵液和固體平板產(chǎn)生的獨(dú)特風(fēng)味，初篩選出產(chǎn)生獨(dú)特香氣的酵母菌。

復(fù)篩：取上述通過初篩得到的酵母菌的發(fā)酵液10 mL于100mL錐形瓶中，再加入10mL蒸餾水，滴加酚酞，用0.1mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至顯色后，轉(zhuǎn)移到10 mL0.1 mol/LNaOH溶液的圓底燒瓶中，水浴加熱皂化回流，取下冷卻至室溫用0.1 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至紅色消失，記錄HCl消耗的體積，每株菌發(fā)酵液3次平行測定取均值，計(jì)算發(fā)酵液的總酯含量[8]。篩選出一株總酯含量較高的菌株。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定

使用試劑盒提取菌株的DNA，利用真菌通用引物NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCT-3'）和NS8（5'-TCCGCAGCTTCACCTACGGA-3'）對18S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。再設(shè)置程序95 ℃保持4 min預(yù)變性，95 ℃保持30 s變性，55 ℃退火50 s，70 ℃延伸40 s，72 ℃延伸10 min，循環(huán)次數(shù)為30次進(jìn)行擴(kuò)增。用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物樣品委托北京天一輝遠(yuǎn)生物有限公司進(jìn)行DNA一代測序檢測。將菌株的測序結(jié)果進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對分析，從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索選取同源性相似的序列，使用MEGA 7軟件建立酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 酵母菌生長曲線的測定

將菌株ZT-01以1%的接種量接種到10 mL YPD液體培養(yǎng)基試管中，28 ℃、180 r/min搖床中培育48 h，設(shè)定在波長600 nm處每隔4 h測定樣品的吸光度值（OD600nm值），3次平行取均值，用Origin 2020軟件作圖。

1.3.5 最適生長溫度及最適生長pH的測定

將菌株ZT-01發(fā)酵液以1%接種量接種到10 mL YPD液體培養(yǎng)基試管中，調(diào)培養(yǎng)基的pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5，于24 ℃、26 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃條件下180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)28 h，在波長600 nm處分別測定OD600nm值。

1.3.6 饅頭制作

添加產(chǎn)香酵母饅頭制備：稱取0.3 g活性干酵母將其加入100 mL無菌水中攪拌均勻，取篩選得到的一株產(chǎn)香酵母以2%的接入量添加到活性干酵母溶液中，攪拌均勻后倒入稱好的面粉中（面粉和水比例2∶1），放入和面機(jī)中和面成型，放入恒溫恒濕箱中醒發(fā)2 h左右（溫度35 ℃，相對濕度80%）。直到成型的饅頭體積膨大為原來的1倍左右。放入蒸鍋中蒸熟后取出。未添加產(chǎn)香酵母饅頭制備方法同上。

1.3.7 香氣成分GC-MS 分析

酵母饅頭香氣成分GC-MS分析。頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction gas chromatography，HS-SPME）條件：取5 g樣品放入固相微萃取樣品瓶中，萃取溫度為85 ℃，轉(zhuǎn)速為600 r/min，萃取時(shí)間為40 min，再放入氣相色譜進(jìn)樣口解吸6 min（溫度200 ℃）。

氣相色譜條件：色譜柱為HP-5（30 m×0.53 mm×5 μm）；載氣為高純氦氣（He）（純度＞99.999%），柱溫50 ℃，保持時(shí)間10 min，以2 ℃/min速度持續(xù)加熱升溫直至250 ℃，保持20 min。質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源；離子源溫度200 ℃；電子能量70 eV；掃描范圍50～800 m/z。根據(jù)所得GC-MS總離子流圖上的峰值，檢索美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）-08數(shù)據(jù)庫得到其對應(yīng)的物質(zhì)，計(jì)算出各種香氣成分的相對含量（%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香酵母菌的初篩

由表1可知，從老酵子中篩選出5株產(chǎn)香酵母菌株，分別編號為ZY-01、ZY-02、ZY-03、ZY-04、ZY-05，5株菌株呈現(xiàn)不同的菌落數(shù)量、產(chǎn)香強(qiáng)度和風(fēng)味特征，菌株ZY-01、ZY-02液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)產(chǎn)生較濃烈的酯香和酒香，菌落數(shù)量生長數(shù)量較多，說明菌株ZY-01和ZY-02的生長活性較高且產(chǎn)香性能較好。菌株ZY-03、ZY-04、ZY-05液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)具有淡淡的果香和酯香其風(fēng)味較弱，菌落數(shù)量生長數(shù)量較少，說明菌株ZY-03、ZY-04、ZY-05的生長活性較低且產(chǎn)香性能較差。

表1 篩選菌株初篩結(jié)果Table 1 Primary screening results of screened strains

2.2 產(chǎn)香酵母菌的復(fù)篩

由圖1可知，5株菌株的總酯含量高低不同，其中菌株ZY-01的發(fā)酵液中總酯含量最高為355.2 mg/L。綜合初篩和復(fù)篩結(jié)果，選擇菌株ZY-01作為產(chǎn)香菌株進(jìn)一步研究。

圖1 篩選菌株復(fù)篩結(jié)果Fig.1 Secondary screening results of screened strains

2.3 菌株ZY-01形態(tài)觀察

菌株ZY-01菌落及細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果見圖2。由圖2A可知，在YPD固體培養(yǎng)基上的菌落的體形態(tài)特征大多為白色圓型，質(zhì)地均勻，菌落表面光滑呈不透明狀，粘稠并散發(fā)出發(fā)酵的香氣。由圖2B可知，涂片滴加結(jié)晶紫染色劑染色細(xì)胞，在100×顯微鏡下觀察，酵母細(xì)胞為紫色多呈橢圓形。

圖2 菌株ZY-01的菌落形態(tài)（A）和細(xì)胞形態(tài)（B）Fig.2 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of strain ZY-01

2.4 菌株ZY-01分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 酵母菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果

將選取的菌株ZY-01進(jìn)一步使用分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株ZY-01 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在500～750 bp之間有一條清晰的亮帶，從而得到了菌株ZY-01的18S rDNA堿基長度。

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR product

2.4.2 序列分析結(jié)果

菌株ZY-01 18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)樹結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌株ZY-01與NCBI同源序列對比結(jié)果可知Wickerhamomyces anomalusstrain DBF29（KT207259.1）的親緣關(guān)系最近，序列的相似度達(dá)到99%。結(jié)合圖3結(jié)果，菌株ZY-01被鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

圖4 菌株ZY-01基于18S rDNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain ZY-01 based on 18S rDNA sequence PCR amplification products

2.5 菌株ZY-01生長特性分析

2.5.1 菌株ZY-01的生長曲線的測定

圖5 菌株ZY-01生長曲線Fig.5 Growth curve of strain ZY-01

由圖5可知，菌株在0～8 h為遲緩期，生長緩慢且時(shí)間較短；經(jīng)過遲緩期后，12～28 h為對數(shù)生長期，此時(shí)期時(shí)間較長，菌株生長速率最大，代謝速率最旺盛；在28 h時(shí)OD600nm值上升至1.75，此時(shí)達(dá)到最大，菌株在28～48 h為穩(wěn)定期，在這期間隨時(shí)間的不斷延長OD600nm值基本保持大致穩(wěn)定，穩(wěn)定期內(nèi)菌株ZY-01 OD600nm值基本都在1.70～1.75。

2.5.2 菌株ZY-01的最適生長溫度及最適pH的測定

圖6 溫度（A）及pH值（B）對菌株ZY-01生長的影響Fig.6 Effect of temperature (A) and pH value (B) on strain ZY-01 growth

由圖6A可知，在不同溫度條件下菌株ZY-01的生物量變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在24～28 ℃時(shí)，菌株ZY-01生物量持續(xù)上升，并在溫度為28 ℃時(shí)達(dá)到最高，OD600nm值為1.82；溫度在28～36 ℃時(shí)，菌株ZY-01生長受到了明顯抑制；當(dāng)溫度＞36 ℃之后，酵母菌的生物量急劇下降，這是由于隨著的溫度升高，菌體出現(xiàn)了自溶現(xiàn)象致使酵母菌生長量減少[9-10]。因此，菌株ZY-01最適溫度為28 ℃。

由圖6B可知，在不同pH條件下OD600nm的生物量呈現(xiàn)出先上升后平緩的趨勢。當(dāng)pH值為3.0～4.0時(shí)，菌株ZY-01的OD600nm值迅速增加；當(dāng)pH值為4.0～7.5時(shí)，菌株ZY-01的生長穩(wěn)定，說明菌株ZY-01在pH值為4.0～7.5范圍內(nèi)生長良好。因此，菌株ZY-01的最適pH值為4.0。

2.6 產(chǎn)香酵母應(yīng)用于發(fā)酵饅頭研究

采用GC-MS法分析添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭和未添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭中的風(fēng)味物質(zhì)的種類和相對物質(zhì)含量分析結(jié)果比較見表2。

表2 兩種饅頭主要風(fēng)味物質(zhì)種類和含量GC-MS分析比較Table 2 Comparison of main flavor substance types and contents in two kinds of Mantou analysis by GC-MS

由表2可知，添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭中主要檢測出物質(zhì)含量較高的風(fēng)味物質(zhì)16種，未添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭中主要檢測出物質(zhì)含量較高的風(fēng)味物質(zhì)12種，其中兩者共同檢測出12種風(fēng)味物質(zhì)，最主要的成分為醇類、酯類、酸類、醛類和酮類化合物，添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭中含有醇類6種，酯類5種，酸類2種，醛類1種，酮類2種，未添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭含有醇類5種，酯類3種，酸類2種，醛類1種，酮類1種。添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭相比未添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭：醇類增加11.27%，酯類增加8.85%，酸類減少10.87%，醛類增加1.03%，酮類增加1.16%。添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭中醇類和酯類物質(zhì)的種類和物質(zhì)含量相比未添加產(chǎn)香酵母饅頭物質(zhì)含量顯著增加（P＜0.05），醛類和酮類物質(zhì)種類和物質(zhì)含量增加差異不顯著（P＞0.05），酸類物質(zhì)含量顯著減少（P＜0.05）。

由表2可知，添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭和未添加產(chǎn)香酵母饅頭發(fā)酵產(chǎn)生的主要香氣成分物質(zhì)有乙醇、異戊醇、苯乙醇、糠醇、丙三醇、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、γ-丁內(nèi)酯、苯乙醛和4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭相比于未添加產(chǎn)香酵母饅頭以上物質(zhì)含量增幅均有較大變化。由此可得出，產(chǎn)香酵母菌對饅頭的風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生了顯著且有利的影響。乙醇具有酒香味和刺激性氣味，苯乙醇具有清新的花香味，可作為食用香精，丙三醇又稱作甘油，該物質(zhì)具有暖甜味可作為甜味劑和保濕物質(zhì)?？反季哂邢阄犊捎米魇称酚孟懔?。乙酸乙酯有甘甜的酒味和水果的清香。γ-丁內(nèi)酯都具有特殊的芳香氣味。乙酸苯乙酯具有花粉的蜂蜜香氣和蘋果樣的果香[11]。苯乙醛具有水仙花香氣，低濃度時(shí)具有櫻桃香味[3]。4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮有糖漿味和焦甜味。除此之外只在添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭中檢測到而未添加產(chǎn)香酵母饅頭沒有檢測到的4種香氣物質(zhì)分別為1-辛烯-3-醇、辛酸乙酯、丁酸異戊酯和苯乙酮。1-辛烯-3-醇有玫瑰花香味和清甜的甘草味[12]。辛酸乙酯具有香甜酒類香氣可作為食品添加劑香料[13-16]。丁酸異戊酯具有強(qiáng)烈的香蕉香氣味[17]。苯乙酮具有山楂的香氣[18]。醇類閾值較高，在饅頭中含量較高是饅頭風(fēng)味組成的重要成分。酯類、醛類和酮類閾值較低[19-20]，雖然在饅頭中含量較低也能使饅頭具有較強(qiáng)香氣。添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭相比未添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭增加了香氣物質(zhì)種類和含量，這些香氣賦予了饅頭獨(dú)特的香氣且對風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大。這也是添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭風(fēng)味口感優(yōu)于未添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭的重要因素。

3 結(jié)論

通過從傳統(tǒng)老酵子中分離出的ZY-01菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和生長特性研究，結(jié)果表明，經(jīng)鑒定ZY-01菌株為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。菌株ZY-01發(fā)酵液的最優(yōu)生長條件：生長時(shí)間為28 h，溫度為28 ℃，pH值為4.0。經(jīng)GC-MS分析對添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭和未添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭中揮發(fā)性成分種類和含量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，兩者發(fā)酵液的揮發(fā)性物質(zhì)中共同的主要香氣成分物質(zhì)有乙醇、異戊醇、苯乙醇、糠醇、丙三醇、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、γ-丁內(nèi)酯、苯乙醛和4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮，除此之外只在產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭中檢測到1-辛烯-3-醇、辛酸乙酯、丁酸異戊酯和苯乙酮這4種香氣物質(zhì)。添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵的饅頭與未添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭相比醇類、酯類物質(zhì)含量分別增加11.27%、8.85%。這些香氣賦予了饅頭獨(dú)特的風(fēng)味口感，這也是添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵饅頭風(fēng)味口感優(yōu)于未添加產(chǎn)香酵母發(fā)酵的饅頭的重要因素。