文/劉彩娟 王永信 任 亮 付文國(guó) 胡格吉勒 高滿(mǎn)慧

（黑龍江克東和平原生態(tài)牧業(yè)有限公司）

支原體為自然界中獨(dú)立生存的最小原核微生物，擁有能夠進(jìn)行自我復(fù)制的最小基因組[1]。支原體能攻擊宿主細(xì)胞，引起宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)并損害宿主細(xì)胞，以便在宿主細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖[2]。其中牛支原體（Mycoplasma Bovis）是一種主要感染牛呼吸道的病原體[3]，能夠持續(xù)感染宿主[4]，并引發(fā)包括牛肺炎、乳房炎在內(nèi)的多種慢性疾病[5，6]。泌乳牛無(wú)法從疾病中及時(shí)恢復(fù)，是牛支原體乳房炎的主要特征，感染支原體2 周后受到感染的乳房會(huì)萎縮，在之后的泌乳期無(wú)法恢復(fù)到之前的產(chǎn)奶量。被感染牛只只能被淘汰或被屠宰，給牧場(chǎng)造成經(jīng)濟(jì)損失[7]。目前由于支原體培養(yǎng)及檢測(cè)方法較繁瑣，其在牧場(chǎng)乳房炎奶樣的流行情況和流行的優(yōu)勢(shì)病原種類(lèi)報(bào)道也較少，且沒(méi)有更好地、更有效地控制牛支原體乳房炎的方法。本文結(jié)合4 家規(guī)模化牧場(chǎng)的支原體檢出情況，初步總結(jié)防控經(jīng)驗(yàn)，以期能為同行提供參考借鑒。

1 材料與方法

1．1 樣品來(lái)源

2013—2019年，牧場(chǎng)獸醫(yī)人員對(duì)4 家規(guī)?；翀?chǎng)在擠奶時(shí)發(fā)現(xiàn)的具有不同臨床癥狀的乳房炎牛只，在不使用任何藥物前第一時(shí)間進(jìn)行奶樣采集，送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離、培養(yǎng)。4 家規(guī)模化牧場(chǎng)的飼養(yǎng)管理方式基本相同。

1．2 樣品采集

采樣人員洗手后帶上一次性手套，用防水記號(hào)筆標(biāo)記采樣管，標(biāo)明采樣日期、牛號(hào)和采樣乳區(qū)。去除附著在乳房和乳頭部位的糞污、墊料，用擠奶前藥浴液藥浴乳頭。使用一次性紙巾或毛巾擦拭每個(gè)乳頭，特別要注意乳頭末端，確保沒(méi)有藥浴液殘留在乳頭上。棄掉頭3～4 把奶，防止乳頭、乳池內(nèi)的細(xì)菌污染奶樣。使用75%酒精棉球或紗布消毒乳頭10～15 s，可更換新的棉球或紙巾進(jìn)行消毒。先從乳頭遠(yuǎn)端開(kāi)始消毒，然后是乳頭孔附近，以避免消毒好的乳頭再次污染，每消毒1 個(gè)乳頭使用1 個(gè)新的棉球，確保乳頭末端不能有酒精滴落。消毒后待乳頭干燥15 s后取樣，采樣時(shí)再打開(kāi)采樣管蓋子，避免乳頭末端接觸采樣管。保持采樣管與牛乳頭呈45°角，防止糞污或牛毛落入管內(nèi)。盡快采樣，先采近端乳頭，而后是遠(yuǎn)端乳頭，采樣至1/3管即可。采樣結(jié)束后立即將采樣管置于冰箱內(nèi)，將檢測(cè)培養(yǎng)。

1．3 檢測(cè)試劑和耗材

1．3．1 培養(yǎng)基

血平板培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、支原體培養(yǎng)基等，均為市售商品化成品，直接使用或按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配置。

1．3．2 試劑及耗材

革蘭氏染色液、香柏油、二甲苯、過(guò)氧化氫（3%H2O2）、稀釋液（生理鹽水/PBS/蛋白胨水/林格氏液）、蒸餾水等。

表1 2013—2019年不同牧場(chǎng)乳房炎奶樣無(wú)生長(zhǎng)和支原體檢測(cè)結(jié)果

1．4 檢測(cè)設(shè)備

生化培養(yǎng)箱：型號(hào)為L(zhǎng)RH-150，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電子顯微鏡：型號(hào)為XSPBM-2CA，上海彼愛(ài)姆光學(xué)儀器制造有限公司；超凈工作臺(tái)：型號(hào)為SW-CJ-2D，蘇州凈化設(shè)備有限公司；高壓蒸汽滅菌器：型號(hào)為L(zhǎng)DZX-75KBS，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；二氧化碳培養(yǎng)箱：型號(hào)為BPN-80CH，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；體式顯微鏡：型號(hào)為XTZ-D，上海光學(xué)儀器廠(chǎng)。PCR檢測(cè)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)完成。

1．5 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EXCEL 2003軟件進(jìn)行整理，運(yùn)用SAS 8.2軟件包中的平衡試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析過(guò)程（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均值的多重比較采用Duncan氏法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2．1 不同牧場(chǎng)乳房炎奶樣無(wú)生長(zhǎng)和支原體檢測(cè)結(jié)果

2013—2019年不同牧場(chǎng)乳房炎奶樣無(wú)生長(zhǎng)和支原體檢測(cè)結(jié)果如表1所示。由表中數(shù)據(jù)可以得出，2013年C牧場(chǎng)無(wú)生長(zhǎng)檢出率為14.89%，支原體檢出率為3.71%；D牧場(chǎng)無(wú)生長(zhǎng)檢出率為24.69%，支原體檢出率為0.56%。2014年C牧場(chǎng)無(wú)生長(zhǎng)檢出為31.82%，支原體檢出率15.18%；D牧場(chǎng)無(wú)生長(zhǎng)檢出率為20.66%，支原體檢出率僅為0.29%。D牧場(chǎng)在2015、2016年無(wú)生長(zhǎng)檢出率分別為32.84%、36.07%，與其他牧場(chǎng)相比較高，但支原體檢出率分別為0.1%、0%。C牧場(chǎng)在2015年無(wú)生長(zhǎng)檢出率在11.11%，支原體檢出率5.32%，支原體檢出率呈下降趨勢(shì)，至2016年支原體下降為0.27%。2013—2019年A、B牧場(chǎng)支原體檢出率均為0%。2017—2019年C、D牧場(chǎng)支原體檢出率均為0%。

表2 2013—2019年不同牧場(chǎng)不生長(zhǎng)和支原體檢出率對(duì)比

2．2 金黃色葡萄球菌感染率較高牧場(chǎng)的全面篩查結(jié)果

在2013年12月底，針對(duì)金黃色葡萄球菌感染率較高的牧場(chǎng)進(jìn)行牛只的全面篩查，結(jié)果見(jiàn)表2。由表可知，B、D牧場(chǎng)的無(wú)生長(zhǎng)檢出率相對(duì)A、C牧場(chǎng)較高，差異顯著（P＜0.05），而C牧場(chǎng)的支原體檢出率顯著高于A(yíng)、B、D牧場(chǎng)（P＜0.05）。

2．3 乳房炎個(gè)體牛只奶樣及大缸奶樣支原體的檢測(cè)情況

2019年抽檢4 個(gè)牧場(chǎng)乳房炎個(gè)體牛只奶樣及大缸奶樣支原體的檢測(cè)情況如圖1～3。結(jié)果顯示，A、B、C、D牧場(chǎng)的乳房炎個(gè)體牛只奶樣及大缸奶樣支原體的PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

3 討論

本文中B、D牧場(chǎng)的無(wú)生長(zhǎng)檢出率相對(duì)A、C牧場(chǎng)較高，差異顯著（P＜0.05）。乳房炎奶樣無(wú)生長(zhǎng)主要分為以下幾個(gè)情況：奶樣中菌量過(guò)少，低于可檢測(cè)范圍；奶樣沒(méi)有被合理儲(chǔ)存，導(dǎo)致細(xì)菌死亡；在奶樣中存在抗生素；奶牛自身免疫系統(tǒng)已將病原體菌清除，但依舊存在假陰性結(jié)果，一般在腸道菌群和金葡萄球菌感染乳房炎病例中常見(jiàn)。某些病原菌需要特殊的培養(yǎng)條件，如支原體。從本文無(wú)生長(zhǎng)結(jié)果較高，但是其支原體檢出率相對(duì)較低的結(jié)果可以看出，無(wú)生長(zhǎng)檢出率與支原體檢出率無(wú)明顯的正相關(guān)趨勢(shì)。因此無(wú)生長(zhǎng)檢出率偏多，不能確定均是由支原體造成的感染，支原體的分離培養(yǎng)還需專(zhuān)門(mén)的培養(yǎng)基。此外，本文中B、D牧場(chǎng)的無(wú)生長(zhǎng)檢出比例較高，還需要分析牧場(chǎng)采樣、保存環(huán)節(jié)及其他優(yōu)勢(shì)致病菌。

C牧場(chǎng)支原體檢出率顯著高于A(yíng)、B、D牧場(chǎng)（P＜0.05），2014年最高檢出率達(dá)到15.18%，隨后逐漸下降，到2017年達(dá)到未檢出。D牧場(chǎng)支原體在2013年有檢出，而2015年下降到0.1%，運(yùn)用PCR檢測(cè)確定C、D牧場(chǎng)乳房炎主要感染Mycoplasma Bovis類(lèi)支原體，而Mycoplasma Leachii類(lèi)支原體為陰性。2016年以后均為檢出率0%，且2019年送檢4 個(gè)牧場(chǎng)的乳房炎奶樣及奶倉(cāng)支原體PCR檢測(cè)結(jié)果均未檢出，與牧場(chǎng)培養(yǎng)方法的結(jié)果一致，這說(shuō)明C、D牧場(chǎng)的乳房炎支原體感染得到了有效的控制。

防控支原體感染，首先需要做好檢測(cè)：一是進(jìn)行針對(duì)性檢測(cè)，主要針對(duì)乳房炎反復(fù)發(fā)病，奶樣感官評(píng)定出現(xiàn)豆腐渣乳、水樣乳及氣味惡臭等，但細(xì)菌分離培養(yǎng)不出細(xì)菌，已排除不是金黃色葡萄球菌感染，產(chǎn)奶量較低的牛只優(yōu)先采樣，檢測(cè)是否是支原體感染。二是每月對(duì)乳房炎發(fā)病牛只進(jìn)行支原體篩查。三是每周定期對(duì)奶倉(cāng)混合樣進(jìn)行支原體篩查，如檢測(cè)出支原體，則應(yīng)對(duì)每舍牛的混合奶樣進(jìn)行篩檢，篩查存在陽(yáng)性牛只的牛舍，并逐級(jí)細(xì)分到該舍每頭牛，如每周對(duì)奶倉(cāng)混合樣進(jìn)行支原體篩查中未檢測(cè)出支原體，則檢測(cè)頻率調(diào)整為每月定期篩查。四是外來(lái)引進(jìn)牛只，或者不同牧場(chǎng)之間轉(zhuǎn)群，要提前做好篩查、檢測(cè)，無(wú)檢出支原體后再歸群。其次，要做好擠奶操作的衛(wèi)生工作，對(duì)于支原體陽(yáng)性牛應(yīng)隔離最后擠奶，而對(duì)于無(wú)胎牛支原體陽(yáng)性牛不再參配到無(wú)奶時(shí)淘汰，對(duì)有胎陽(yáng)性牛產(chǎn)犢時(shí)初乳廢棄、隔離，最后擠奶。Yuri等（2020）研究已經(jīng)再次證實(shí)，做好擠奶的衛(wèi)生控制，能夠有效防止奶牛之間的支原體傳播[8]。對(duì)于因支原體感染的反復(fù)發(fā)作、久治不愈的乳房炎牛只，或者肺炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、肢蹄病、乳房炎等存在多種慢性疾病的牛只，應(yīng)及時(shí)淘汰。C

圖1 A牧場(chǎng)乳房炎奶樣及奶倉(cāng)支原體PCR檢測(cè)結(jié)果

圖2 B牧場(chǎng)乳房炎奶樣及奶倉(cāng)支原體PCR檢測(cè)結(jié)果

圖3 C、D牧場(chǎng)乳房炎奶樣及奶倉(cāng)支原體PCR檢測(cè)結(jié)果