強(qiáng)勝林 劉濤 賈永龍* 徐克武 于海洋 蔣宜偉 梁恬

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020 2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的特點(diǎn)是骨微結(jié)構(gòu)損傷和骨強(qiáng)度降低，骨折風(fēng)險高。骨質(zhì)疏松性骨折通常與骨密度(bone mineral density，BMD)降低有關(guān)，是老年人的主要公共衛(wèi)生問題[1]。然而，目前尚不完全了解OP相關(guān)骨破壞的分子機(jī)制。自噬是一種生理細(xì)胞機(jī)制，它降解和循環(huán)蛋白質(zhì)，以維持足夠的氨基酸水平，以達(dá)到生存的目的[2]。它涉及形成細(xì)胞溶質(zhì)雙膜小泡(自噬體)，高自噬條件能夠促進(jìn)半胱天冬酶依賴性凋亡細(xì)胞死亡[3]。自噬在OP發(fā)育和進(jìn)展中起到重要作用，自噬蛋白對于破骨細(xì)胞皺褶邊緣的形成、其分泌功能和骨吸收很重要[4]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察補(bǔ)腎固本方對大鼠OP模型PI3K/AKT/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化，以期為補(bǔ)腎固本方在治療OP方面的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及藥物

10月齡SPF級健康SD 大鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量(280±20)g，生產(chǎn)許可證號為SCXK(甘)2016-0052，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。補(bǔ)腎固本方(由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑室制成水煎劑，高溫封瓶，4 ℃保存?zhèn)溆?，注射用青霉素鈉(北京悅康凱悅制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H11020456 批號：S1526247)。

1.2 試劑及儀器

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時定量PCR試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，批號：DRR042、RR863 A)，E.Z.N.A. Total RNA KitⅠ(美國omega公司，生產(chǎn)批號：R6817-02)，PBS緩沖液(北京藍(lán)博斯特生物科技有限公司)，TRIZOL試劑(Invitrogen life technologies)，瓊脂糖(上海川翔生物科技有限公司)。PI3K、p-AKT、mTOR兔多克隆抗體(美國CST公司，批號：4617P、4260P、4235P)；羊抗兔二抗(批號：QE225340)均購自美國Thermo公司；血清雌激素(E2)、骨鈣素(BGP)、骨特異性堿性磷酸酶(BALP)(南京建成生物工程研究所，批號：20160425、20160672、20161032)；PI3K抑制劑LY294002(美國GLPBIO公司，貨號: 9951S)；奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(JAPAN)；PCR熱循環(huán)儀 S1000(美國伯樂 Bio-rad 公司)；熒光定量PCR儀(美國Bio-rad iCycler iQ伯樂公司)。

1.3 模型分組及制備

隨機(jī)分為5組，每組20只。分為正常組(C組)、模型組(M組)、補(bǔ)腎固本方組(B組)、補(bǔ)腎固本方+ PI3k受體特異性阻斷劑 LY294002組(B+L組)、PI3k受體特異性阻斷劑 LY294002組(L組)。參照文獻(xiàn)[5]報道的方法，腹腔麻醉后，沿腹正中線劍突下1.5 cm處做長約2.0 cm縱向切口，C組僅切開皮膚后直接將其縫合，切開皮膚、筋膜，分離腹部肌肉，打開腹膜，暴露腹腔。沿子宮下角向上仔細(xì)尋找卵巢，找到后小心慢慢提出，縫線結(jié)扎輸卵管及組織。造模組完整摘除雙側(cè)卵巢，將子宮納入原位，仔細(xì)止血，逐層縫合。術(shù)后一周連續(xù)臀肌注射青霉素。

1.4 干預(yù)方法

參考《中藥藥理研究方法學(xué)》[6]，根據(jù)人和大鼠的計量折算系數(shù)確定所給藥量。治療組得出大鼠的千克體重劑量約為7 mg/(kg·d)，B組和B+L組給予補(bǔ)腎固本方1.8 mL/(kg·d)灌胃。B+L組和L組給予腹腔注射外源性LY294002(劑量為5.5 mg/kg)；M組和L組造模后給予0.9%生理鹽水灌胃；C組自由飲水。灌胃12周后處死大鼠并取材。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1血清生化指標(biāo)檢測：心臟取血后，在4℃下以3 000 r/min離心20 min，按照規(guī)范檢測E2、BGP、ALP的水平。

1.5.2RT-PCR法檢測LC3、Beclin1、caspase-9 mRNA的表達(dá)：分離和粉碎的股骨組織中提取總RNA。使用cDNA合成試劑盒將總共1 μg的RNA反向轉(zhuǎn)錄到cDNA。pcr在Stepone實(shí)時PCR系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng)；Thermo Fisher Scientific，Inc.)上進(jìn)行，GAPDH作為內(nèi)部控制。PCR使用試劑說明進(jìn)行熱循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物序列 Table 1 Primer sequences

1.5.3Western blotting法檢測PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表達(dá)：加入緩沖液提取蛋白，濕式電泳儀轉(zhuǎn)膜300 mA、60 min；5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h；Ⅰ抗和內(nèi)參照抗體 4 ℃孵育 16 h；加入稀釋好的二抗(抗兔 IgG)，在室溫下孵育1 h，使用ECL(Amersham Pharmacia Biotech)顯影，并使用ChemiDoc XRS(BioRad)顯色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測血清中E2、BGP、ALP水平

與C組比較，M組血清中E2水平降低，BGP、ALP水平增高(P<0.05)；與M組比較，B組血清中E2水平增高，BGP、ALP水平明顯降低(P<0.05)；與B組相比，B+L組E2水平顯著降低，BGP、ALP水平顯著增高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清中E2、BGP、ALP含量比較Table 2 Comparison of serum levels of E2, BGP, and ALP among the groups

2.2 PCR法檢測各組LC3、Beclin1、Caspase-9 mRNA的表達(dá)結(jié)果

與C組比較，M組脛骨組織LC3、Beclin1mRNA的表達(dá)顯著降低，Caspase-9 mRNA的表達(dá)顯著增高；與M組比較，B組脛骨組織LC3、Beclin1 mRNA表達(dá)顯著增高，Caspase-9 mRNA的表達(dá)顯著降低；與B組相比，B+L組的脛骨組織LC3、Beclin1 mRNA的表達(dá)顯著降低，Caspase-9 mRNA的表達(dá)顯著增高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠中補(bǔ)腎固本方對脛骨組織凋亡相關(guān)因子LC3、Beclin1、Caspase-9含量的比較

2.3 補(bǔ)腎固本方對脛骨組織PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表達(dá)的影響

與C組比較，M組脛骨組織PI3K、p-AKT、mTOR的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，與M組比較，B組脛骨組織PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，與B組相比，B+L組的脛骨組織PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，提示LY294002干預(yù)降低了補(bǔ)腎固本方對股骨組織PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活作用。見圖1、表4。

3 討論

目前，針對骨質(zhì)疏松癥的有效治療方法主要是降低再吸收率或促進(jìn)骨形成，包括雙膦酸鹽、降鈣素、雌激素和激素替代療法(HRT)[7]。雖然這些藥物仍在臨床上用于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥，但它們往往有不必要的副作用。盡管HRT仍然是預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的良好治療方法，但這些藥物可以刺激子宮內(nèi)膜增生，增加子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險，或者增加心血管疾病和VTE的風(fēng)險[8]。口服雙膦酸鹽最常見的副作用是輕微的上消化道癥狀，靜脈注射雙膦酸鹽可能會出現(xiàn)低血鈣血癥和促炎細(xì)胞因子(TNFA、干擾素-G和IL-6)釋放引起急性期反應(yīng)(發(fā)熱、肌痛、淋巴細(xì)胞減少、CRP升高)。因此，制定一種預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的替代策略已迫在眉睫。

圖1 各組大鼠PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表達(dá)比較(Western blot)Fig.1 Comparison of protein expressions of PI3K, p-AKT, and mTOR among the groups (Western blot)

表4 各組大鼠中補(bǔ)腎固本方對脛骨組織PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表達(dá)的影響

已經(jīng)有許多生物學(xué)和藥理學(xué)研究，無論是在體外還是在體內(nèi)，中藥維持或促進(jìn)骨骼健康具有潛在的有益作用。中藥治療骨質(zhì)疏松癥在我國已有悠久的歷史，腎臟強(qiáng)健可促進(jìn)骨髓的生長，從而增強(qiáng)骨骼的強(qiáng)度。相反，腎臟弱往往會導(dǎo)致骨骼發(fā)育不良，導(dǎo)致類似骨質(zhì)疏松癥的癥狀，如腰痛和背痛，進(jìn)而導(dǎo)致骨骼脆弱性骨折的風(fēng)險增加。補(bǔ)腎固本方由當(dāng)淫羊藿、補(bǔ)骨脂、炙黃芪、狗脊、黨參、肉蓯蓉、當(dāng)歸、烏藥等藥物組成[9]。本組方中淫羊藿與狗脊配伍，補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，補(bǔ)骨脂與肉蓯蓉配伍溫補(bǔ)脾腎之陽，四藥合用以補(bǔ)腎益精壯骨為主，且補(bǔ)中有潤、暖而不燥，共為君藥；炙黃芪與黨參配伍補(bǔ)中氣以健脾和胃，培補(bǔ)后添以助君藥補(bǔ)腎之力；熟地黃為養(yǎng)精填髓之品，配伍溫補(bǔ)腎陽之鹿角膠，有“陰中求陽”之義，四藥合用，共為臣藥；當(dāng)歸補(bǔ)血活血，烏藥行氣止痛，土鱉蟲逐瘀續(xù)筋，三藥合用以應(yīng)對OP患者常發(fā)血虛、氣滯、血瘀等證，共為佐使藥，全方以補(bǔ)脾腎為主，兼以活血行氣，共湊髓養(yǎng)骨生之效。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生主要由于絕經(jīng)后機(jī)體雌激素水平低下，OC增殖、骨吸收增加，其中E2是作用最強(qiáng)、最為主要的一種雌激素[10]。血清E2濃度反映了機(jī)體雌激素水平。骨代謝標(biāo)志物則體現(xiàn)了骨形成與骨吸收之間骨代謝的特點(diǎn)與水平，是評估骨質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。研究認(rèn)為，BGP和BALP均由OB分泌產(chǎn)生，均可反映OB的活性，可作為骨形成的特異性指標(biāo)[11]。

自噬主要作為一種適應(yīng)過程來保護(hù)生物體抵御各種疾病。近年來，研究人員指出自噬在維持骨內(nèi)平衡中起著重要作用，而PI3K/Akt信號與骨組織代謝有著密切的關(guān)系[12]。在成骨細(xì)胞中，PI3K/Akt途徑的激活可以刺激增殖和分化，同時抑制凋亡。此外，PI3K/Akt途徑可影響破骨細(xì)胞的形成。也有報告稱，缺乏AKT1或AKT2的小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨缺損，以及其他發(fā)育缺陷[13]。相反，Akt的激活通過阻斷小鼠成骨細(xì)胞磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸3-磷酸酶的表達(dá)來增加骨量。Akt是也是mTOR激活的關(guān)鍵性因子，激活mTOR 信號通路，進(jìn)而抑制自噬，從而發(fā)揮自噬調(diào)節(jié)的分子“開關(guān)”[14]。Caspases-9是啟動半胱天冬酶，激活下游執(zhí)行者半胱天冬酶，如3、6和7，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。通過PI3K/AKT/mTOR途徑降低Caspases-9活性，從而減輕細(xì)胞損傷所致的細(xì)胞凋亡。在自噬過程中，LC3是將細(xì)胞內(nèi) LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化成LC3Ⅱ，并且整合到自噬體膜上，當(dāng)自噬體融合成溶酶體時 LC3Ⅱ?qū)唤到猓?dāng)發(fā)生細(xì)胞損傷時可以檢測到LC3Ⅱ的濃度顯著增高，因?yàn)榇藭r自噬體的融合障礙，LC3Ⅱ降解減少。Beclin-1蛋白也是重要的自噬分子標(biāo)志，參與自噬前體的形成[15]。最近對PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究強(qiáng)調(diào)了PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在OP中的作用。因此，在正常和病理?xiàng)l件下，這一途徑對于維持骨骼穩(wěn)定性至關(guān)重要[16]。因此，它作為OP的治療靶點(diǎn)具有巨大的潛力。

研究結(jié)果表明，補(bǔ)腎固本方明顯增高E2水平，降低BGP、BALP含量，說明大鼠卵巢切除后，雌激素水平下降，OC和OB活性均增強(qiáng)，骨轉(zhuǎn)換速率加快，骨量流失，同時LC3、Beclin1的表達(dá)量增加，Caspase-9、PI3K、p-AKT、mTOR的表達(dá)量明顯降低。提示補(bǔ)腎固本方通過抑制大鼠PI3K/AKT/mTOR信號通路激活，從而保護(hù)小梁結(jié)構(gòu)，降低破骨細(xì)胞分化。這些可能是補(bǔ)腎固本方防治OP的機(jī)制之一，但具體的分子生物學(xué)作用機(jī)理仍需要進(jìn)一步的研究。