鄧靜 張景嵐 周廣朋 鐘莉

四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072

骨質(zhì)疏松癥是一種多種因素(如絕經(jīng)、礦物質(zhì)代謝異常、骨代謝異常等)引起的骨密度、骨質(zhì)量下降性疾病[1]。骨質(zhì)疏松癥患者臨床主要表現(xiàn)為疼痛、脊柱變形、易骨折等，疼痛可降低患者生活質(zhì)量，脊柱變形可使患者活動(dòng)受限，易骨折可導(dǎo)致患者致殘，不僅給患者生活質(zhì)量帶來(lái)影響，而且也給社會(huì)、家庭和個(gè)人帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。當(dāng)前，骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制研究主要集中于礦物質(zhì)代謝異常方面，鈣攝入量不足容易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥，即低鈣骨質(zhì)疏松癥[3]。鎂元素?cái)z入量與骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的關(guān)系研究還存在爭(zhēng)論，但較多研究認(rèn)為鎂元素?cái)z入量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥發(fā)生，同時(shí)臨床也有研究證實(shí)低鈣高鎂飲用水的鈣鎂元素交互作用也是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要原因[4-5]。槲皮素是具有雌激素拮抗劑活性的雌激素類(lèi)物質(zhì)，其雌激素拮抗劑活性包括抗菌、抗腫瘤、抗病毒等[6]。近年來(lái)，臨床研究發(fā)現(xiàn)槲皮素也具有增加成骨細(xì)胞分化活性和抑制破骨細(xì)胞骨吸收的藥理作用，在維持骨代謝穩(wěn)定方面可發(fā)揮功效[7]。然而槲皮素應(yīng)用于鈣鎂元素交互作用骨質(zhì)疏松臨床防治的研究未見(jiàn)報(bào)道，鑒于此，本研究以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方式觀察槲皮素對(duì)低鈣高鎂飲食大鼠血清礦量和骨代謝水平的影響，為骨質(zhì)疏松臨床防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD成年黑色大鼠(供貨商：中科院生物學(xué)研究所；質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(京)2017-0034；動(dòng)物倫理審查證號(hào)：SP-DW-SMP-09-015-01)60只，鼠齡為2～4個(gè)月，平均月齡(2.08±0.24)月，體重300～330 g，平均體重(317.23±10.14) g。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物：槲皮素：購(gòu)自上海研生實(shí)業(yè)有限公司，藥品批文：CS-0020-0807，藥品規(guī)格：50 mL/瓶，槲皮素含量200 μg/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1適應(yīng)性喂養(yǎng)及動(dòng)物分組：動(dòng)物置于符合中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量國(guó)家級(jí)清潔標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)，溫度設(shè)定在20 ℃～25 ℃，濕度為40%～70%，飼料為顆粒飼料(SCXK黑2018-008)，飲用水為滅菌水。均適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和槲皮素喂養(yǎng)組，每組各20只。

1.2.2低鈣高鎂飲食骨質(zhì)疏松造模：適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，模型對(duì)照組和槲皮素喂養(yǎng)組均進(jìn)行低鈣高鎂(鈣5 mg/L，鎂60 g/L的蒸餾水溶液，由硫酸鈣、硫酸鎂、蒸餾水按比例配置)喂養(yǎng)3個(gè)月，參考《中國(guó)老年骨質(zhì)疏松診療指南(2018)》[8]行大鼠第2腰椎QCT骨密度絕對(duì)值檢測(cè)，以骨密度絕對(duì)值<80 mg/cm3為骨質(zhì)疏松造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)喂養(yǎng)方法：空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)期間正常喂養(yǎng)。模型對(duì)照組造模成功后正常喂養(yǎng)3個(gè)月。槲皮素喂養(yǎng)組造模期間給予槲皮素股動(dòng)脈注射，給藥劑量按體重比計(jì)算槲皮素給藥量，雄性SD成年黑色大鼠體重取40只大鼠的平均體重317.23 g，成人標(biāo)準(zhǔn)給藥量為1000 μg/(kg·d)[9]，成人體重取值120 kg，計(jì)算可得成年大鼠的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)給藥量為2.64 μg/(kg·d)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1一般情況觀察：記錄整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間大鼠的日常飲食量、飲水量、體重、毛發(fā)、毛發(fā)色澤、活動(dòng)等情況。

1.3.2血清礦量及骨代謝指標(biāo)。分別于低鈣高鎂喂養(yǎng)前(實(shí)驗(yàn)前)和給藥喂養(yǎng)3個(gè)月時(shí)(實(shí)驗(yàn)后)兩個(gè)時(shí)刻點(diǎn)采集大鼠耳根靜脈血0.2 mL進(jìn)行血清礦量及骨代謝指標(biāo)測(cè)定。包括血清礦量(血鈣、血鎂、血磷)、骨吸收相關(guān)指標(biāo)[Ⅰ型膠原聯(lián)蛋白羧基末端肽(CTX1)、I型膠原氨基酸延長(zhǎng)肽(tPINP)]、骨形成相關(guān)指標(biāo)[骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(BGP)]。檢測(cè)方法：作4 000 r/min的離心處理10 min后，取上清-60 ℃保存。然后采用ELISA法測(cè)定BALP、CTX-1、tPINP的表達(dá)水平(試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司)，采用放射免疫法測(cè)定BGP水平(試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche Diagnostic公司)，采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血鈣、血鎂、血磷含量，檢測(cè)過(guò)程中嚴(yán)格按照各檢測(cè)項(xiàng)目試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

實(shí)驗(yàn)期間，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和槲皮素喂養(yǎng)組大鼠無(wú)死亡?？瞻讓?duì)照組、模型對(duì)照組和槲皮素喂養(yǎng)組大鼠的日常飲食量、飲水量、體重等一般行為均無(wú)顯著變化，且模型對(duì)照組和槲皮素喂養(yǎng)組大鼠的日常飲食量、飲水量、體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)后，空白對(duì)照組、槲皮素喂養(yǎng)組大鼠活動(dòng)靈敏有力，毛發(fā)光潤(rùn)(圖1 A、1B)，模型對(duì)照組大鼠反應(yīng)較為遲鈍，毛發(fā)稍顯暗淡(圖1C)。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后一般情況比較

圖1 實(shí)驗(yàn)大鼠毛發(fā)色澤、毛質(zhì)觀察 A：槲皮素喂養(yǎng)組；B：空白對(duì)照組；C：模型對(duì)照組Fig.1 Observation on hair color and quality of experimental rats. A: Quercetin feeding group; B: Blank control group; C: Model control group

2.2 血清礦量情況

空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和槲皮素喂養(yǎng)組大鼠實(shí)驗(yàn)前的血清礦量(血鈣、血鎂、血磷)比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。模型對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)后的血鈣量、血磷量下降，血鎂量提升，與實(shí)驗(yàn)前比較，差異具有顯著性(P<0.05)。槲皮素喂養(yǎng)組大鼠實(shí)驗(yàn)后的血鈣量、血磷量、血鎂量與實(shí)驗(yàn)前比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。槲皮素喂養(yǎng)組大鼠實(shí)驗(yàn)后的血鈣量、血磷量均顯著高于模型對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)后，槲皮素喂養(yǎng)組大鼠實(shí)驗(yàn)后的血鎂量均顯著低于模型對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)后，差異具有顯著性(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

2.3 骨形成指標(biāo)情況

空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和槲皮素喂養(yǎng)組大鼠實(shí)驗(yàn)前的骨形成指標(biāo)(BALP、BGP)比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。模型對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)后的BALP下降，BGP提升，與實(shí)驗(yàn)前比較，差異具有顯著性(P<0.05)。槲皮素喂養(yǎng)組大鼠實(shí)驗(yàn)后的骨形成指標(biāo)(BALP、BGP)與實(shí)驗(yàn)前比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。槲皮素喂養(yǎng)組大鼠實(shí)驗(yàn)后的BALP顯著高于模型對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)后，槲皮素喂養(yǎng)組大鼠實(shí)驗(yàn)后的BGP均顯著低于模型對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)后，差異具有顯著性(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后血清礦量比較

表3 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后骨形成指標(biāo)比較

2.4 骨吸收指標(biāo)情況

空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和槲皮素喂養(yǎng)組大鼠實(shí)驗(yàn)前的骨吸收指標(biāo)(CTX1、tPINP)比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。模型對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)后的骨吸收指標(biāo)(CTX1、tPINP)均提升，與實(shí)驗(yàn)前比較，差異具有顯著性(P<0.05)。槲皮素喂養(yǎng)組大鼠實(shí)驗(yàn)后的骨吸收指標(biāo)(CTX1、tPINP)與實(shí)驗(yàn)前比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。槲皮素喂養(yǎng)組大鼠實(shí)驗(yàn)后的骨吸收指標(biāo)(CTX1、tPINP)顯著低于模型對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)后，差異具有顯著性(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后骨吸收指標(biāo)比較

3 討論

據(jù)估計(jì)，我國(guó)骨質(zhì)疏松癥人群高達(dá)1億人以上，占比已經(jīng)達(dá)總?cè)丝诘?%以上，且占比呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，同時(shí)隨著人口老齡化，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病越來(lái)越多，使骨質(zhì)疏松癥防治成為當(dāng)代醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)[10]。骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的根本原因在于骨吸收和骨形成功能失衡。目前學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制包括4個(gè)方面：雌激素分泌異常、骨鈣缺乏、系統(tǒng)性骨激素調(diào)控異常和遺傳受體異常，其中骨鈣缺乏是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的最主要原因[11]。臨床大劑量補(bǔ)充鈣元素可導(dǎo)致機(jī)體軟骨組織嚴(yán)重鈣化，臨床有補(bǔ)充鎂元素替代補(bǔ)充鈣元素治療骨質(zhì)疏松癥，且證實(shí)確有實(shí)效，這引發(fā)了鎂元素與骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的關(guān)系方面研究的開(kāi)端[12]。鎂元素可通過(guò)荷爾蒙及其他調(diào)節(jié)因子間接對(duì)機(jī)體骨組織代謝產(chǎn)生影響，可促進(jìn)機(jī)體骨形成，有研究顯示無(wú)論補(bǔ)鈣多少，若不聯(lián)合補(bǔ)充鎂元素，仍會(huì)產(chǎn)生骨質(zhì)疏松癥[13]。我國(guó)學(xué)者譚瑤[14]和外國(guó)學(xué)者Lucia等[15]均報(bào)道了本地區(qū)低鈣高鎂飲用水使本地區(qū)骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率高于其他地區(qū)，可見(jiàn)鎂、鈣元素的交互作用可提升骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率。本研究以低鈣高鎂飲食建立了鈣鎂交互作用骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，從模型構(gòu)建結(jié)果來(lái)看，大鼠骨密度值達(dá)到了低于80 mg/cm3的要求，同時(shí)模型對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)后的血鈣量、血磷量、BALP均下降，血鎂量、BGP、CTX1、tPINP均提升，與實(shí)驗(yàn)前比較差異顯著(P<0.05)。可見(jiàn)模型構(gòu)建較為成功，且也證實(shí)了鈣鎂交互作用可誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生。

本研究觀察了槲皮素對(duì)低鈣高鎂飲食骨質(zhì)疏松癥大鼠的生長(zhǎng)、血清礦量、骨代謝水平的影響。SD大鼠一般于出生10周齡(2.5個(gè)月左右)后性器官發(fā)育成熟，3個(gè)月后骨骼發(fā)育成熟，在此期間SD大鼠可進(jìn)入成年期，成年期SD大鼠生長(zhǎng)發(fā)育受遺傳和環(huán)境因素影響較小，因此可采取營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給方式對(duì)大鼠生長(zhǎng)進(jìn)行干預(yù)[16]。本研究采用雄性SD成年大鼠進(jìn)行研究，可避免遺傳和環(huán)境因素對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響。本研究顯示，與適應(yīng)性喂養(yǎng)期間比較，實(shí)驗(yàn)期間模型對(duì)照組和槲皮素喂養(yǎng)組大鼠的日常飲食量、飲水量、體重等一般行為均無(wú)顯著變化，且模型對(duì)照組和槲皮素喂養(yǎng)組大鼠的日常飲食量、飲水量、體重比較無(wú)差異性，雖然槲皮素喂養(yǎng)組實(shí)驗(yàn)大鼠更具活力，毛發(fā)更光潤(rùn)，但可以認(rèn)為槲皮素對(duì)低鈣高鎂飲食大鼠的生長(zhǎng)基本無(wú)影響。血鈣、血鎂、血磷均是與機(jī)體骨代謝相關(guān)的重要礦物質(zhì)，可在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。本研究結(jié)果顯示，槲皮素喂養(yǎng)組大鼠實(shí)驗(yàn)后的血鈣量、血磷量均顯著高于模型對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)后，槲皮素喂養(yǎng)組大鼠實(shí)驗(yàn)后的血鎂量均顯著低于模型對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)后，提示槲皮素對(duì)低鈣高鎂飲食大鼠異常血清礦量有改善作用。血鈣、血鎂、血磷等形成的血清礦物質(zhì)調(diào)節(jié)系統(tǒng)是一個(gè)互相聯(lián)系、互相制約的整體，當(dāng)血鈣、血磷含量下降和血鎂含量上升時(shí)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體甲狀旁腺激素分泌增加，促進(jìn)1α-醇化酶活性和25(OH)2D3的合成[17]。25(OH)2D3不但可抑制骨代謝相關(guān)鈣結(jié)合蛋白生成，而且會(huì)抑制骨代謝水平[18]。結(jié)合本研究槲皮素對(duì)低鈣高鎂飲食大鼠異常血清礦量的改善作用，提示槲皮素可起到防治骨質(zhì)疏松癥的作用。在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生過(guò)程中，骨代謝水平的作用明顯，其中主要起作用包括骨吸收相關(guān)指標(biāo)、骨形成相關(guān)指標(biāo)等，但具體作用機(jī)制當(dāng)前并無(wú)確切定論。王華林等[19]認(rèn)為骨形成指標(biāo)BALP和BGP可反映成骨細(xì)胞成熟度和物理活性，是骨形成功能的表型標(biāo)志物，BALP下調(diào)或BGP上調(diào)均可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。Akatau等[20]認(rèn)為骨吸收指標(biāo)CTX-1、tPINP上調(diào)均可導(dǎo)致骨密度下降，最終引發(fā)骨質(zhì)疏松癥。在本研究中，槲皮素喂養(yǎng)組大鼠實(shí)驗(yàn)后的血鈣量、血磷量、BALP均顯著高于模型對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)后(P<0.05)，但與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；槲皮素喂養(yǎng)組大鼠實(shí)驗(yàn)后的血鎂量、BGP、CTX1、tPINP均顯著低于模型對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)后(P<0.05)。研究結(jié)果提示槲皮素可對(duì)低鈣高鎂飲食大鼠異常骨代謝水平有改善作用，可能原因在于槲皮素具有增加成骨細(xì)胞分化活性和可抑制破骨細(xì)胞骨吸收的功效，使槲皮素喂養(yǎng)組大鼠的骨吸收和骨形成保持動(dòng)態(tài)平衡[21-22]。結(jié)合槲皮素對(duì)低鈣高鎂飲食大鼠異常骨代謝的改善作用，提示槲皮素可起到預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的作用。

綜上所述，鎂、鈣元素的交互作用可誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生，槲皮素可顯著改善低鈣高鎂飲食大鼠血清礦量和骨代謝水平，可能在低鈣高鎂交互作用誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防中起到重要作用。但本研究?jī)H為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將槲皮素應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥臨床預(yù)防，仍需要前瞻性研究的證實(shí)。