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        葛根素對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折骨痂血管形成的影響

        2020-08-06 07:27:04鮑根強(qiáng)肖春來(lái)張國(guó)輝李華趙曉亮王泉
        中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志 2020年5期
        關(guān)鍵詞:去勢(shì)葛根素小梁

        鮑根強(qiáng) 肖春來(lái) 張國(guó)輝 李華 趙曉亮 王泉

        哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院手足外科,河北 衡水 053000

        骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是以骨量減少,骨密度(bone mineral density,BMD)降低,骨微結(jié)構(gòu)退化,骨脆性增加為主的一種全身性系統(tǒng)性疾病,骨折風(fēng)險(xiǎn)增高,骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture,OPF)是OP最嚴(yán)重的并發(fā)癥,嚴(yán)重威脅老年人群的健康和生活質(zhì)量[1]。骨質(zhì)量下降導(dǎo)致骨質(zhì)疏松,使得骨折愈合的組織學(xué)基礎(chǔ)變差,骨折愈合延遲[2]。因此,OPF的防治和治療已成為醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)之一。中草藥治療OP歷史悠久,具備療效顯著、價(jià)格低、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn),研究發(fā)現(xiàn)葛根素可用于臨床OP的預(yù)防和治療,可促進(jìn)去卵巢大鼠骨折愈合[3]。本研究主要探討葛根素對(duì)OPF骨痂血管形成及骨折愈合的影響,為OPF治療提供臨床應(yīng)用理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        60只SPF級(jí)健康雌性SD大鼠,3月齡,體重(320±30)g,訂購(gòu)于北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所(合格證號(hào)SCXK 京2017-002)。葛根素注射液(100 mg/支,陜西安康制藥廠,100 mg/支,批號(hào):1610053),柜式X線照片機(jī)購(gòu)置于美國(guó)Hologic公司,ELISA檢測(cè)試劑盒訂購(gòu)于武漢云克隆科技股份有限公司,兔抗鼠VEGF和BMP-2多克隆抗體均購(gòu)于武漢博士德生物有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù):60只SPF級(jí)健康SD大鼠,于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)屏障環(huán)境伺養(yǎng);實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為假手術(shù)組、去勢(shì)組、葛根素組,假手術(shù)組僅切除部分脂肪組織,去勢(shì)組、葛根素組均行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。4周后確認(rèn)骨質(zhì)疏松造模成功后,各組均行左側(cè)股骨干閉合性骨折髓內(nèi)固定術(shù),于造模成功后第2天給予不同藥物干預(yù),假手術(shù)組、去勢(shì)組:皮下注射0.9% Nacl 5 mL/kg,1次/d;葛根素組:皮下注射葛根素35 mg/kg,1次/d。連續(xù)用藥6周。各組大鼠分籠飼養(yǎng)。

        1.2.2構(gòu)建去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松骨折模型:參照羅靜華等[4]構(gòu)建去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折模型的建立與內(nèi)固定方法,術(shù)后常規(guī)青霉素80萬(wàn)U肌肉注射,預(yù)防感染。造模成功后于術(shù)后第2 天給予各組不同藥物干預(yù)。

        1.2.3組織標(biāo)本處理:攝片后急性大失血法處死大鼠,左心室采血3~5 mL,離心,收取血清1~2 mL,-20 ℃保存?zhèn)溆?。剝離取出右股骨骨痂組織,10%甲醛固定24 h,10%硝酸脫鈣6周,制作組織切片,室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.4放射性(X線)檢查:術(shù)后6周進(jìn)行X線攝片,觀察各組大鼠骨折端骨痂生長(zhǎng)和骨折線模糊情況。每組選取20只大鼠,放射學(xué)評(píng)估采用Warden等[5]的X線評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估,依據(jù)骨折斷端表現(xiàn)行骨折愈合評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):沒(méi)有愈合:1分;骨痂形成不明顯:2分;骨折部分愈合:3分;骨折線逐漸消失,骨痂逐漸吸收消失:4分;完全愈合:5分。

        1.2.5ELISA法檢測(cè)血清濃度:采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清BMP-2和VEGF濃度,參照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作,以450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各組的吸光度值(OD值)。

        1.2.6HE染色:參照HE染色法實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作[6],光鏡下觀察染色并采集圖片。選取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)新生毛細(xì)血管數(shù),取其平均值。

        1.2.7免疫組織化學(xué)染色法:參照免疫組織化學(xué)染色法步驟進(jìn)行操作[7]。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析,免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用免疫反應(yīng)評(píng)分(IRS)進(jìn)行測(cè)定。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        2 結(jié)果

        2.1 骨折愈合觀察及評(píng)分

        假手術(shù)組骨折端骨折線幾乎模糊或消失,骨痂大量生長(zhǎng),體積較大,骨痂連接包饒骨折斷端周圍及骨皮質(zhì),連接緊密,并開(kāi)始重建塑形,斷端髓腔再通;去勢(shì)組骨斷端骨折線依然清晰可見(jiàn),骨痂未見(jiàn)明顯生長(zhǎng),斷端骨痂未連接,骨折愈合欠佳;葛根素組骨折線部分模糊或消失,較多骨痂生長(zhǎng),骨折端有骨痂包繞連接,部分愈合。去勢(shì)組較假手術(shù)組骨折愈合評(píng)分顯著降低(P<0.05),葛根素組較去勢(shì)組骨折愈合評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表1。

        圖1 X線觀察骨折愈合情況 A:假手術(shù)組;B:去勢(shì)組;C:葛根素組。Fig.1 X-ray observation of fracture healing. A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

        表1 各組大鼠骨折愈合評(píng)分比較Table 1 Comparison of fracture healing scores among rats in each group

        2.2 血清BMP-2和VEGF濃度

        去勢(shì)組較假手術(shù)組血清BMP-2和VEGF濃度均顯著降低(P<0.05),葛根素組較去勢(shì)組血清BMP-2和VEGF濃度均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

        表2 各組大鼠血清BMP-2和VEGF濃度比較Table 2 Comparison of serum BMP-2 and VEGF concentrations among the groups

        2.3 骨痂組織學(xué)觀察

        假手術(shù)組骨痂組織可見(jiàn)大量骨小梁生長(zhǎng)旺盛,排列致密有序,互相交錯(cuò)網(wǎng)狀,大量成骨細(xì)胞及新生小血管等成熟骨組織;去勢(shì)組骨痂組織可見(jiàn)少量骨小梁,生長(zhǎng)稀疏,排列紊亂,大量纖維軟骨細(xì)胞等纖維組織,成骨細(xì)胞及新生小血管少見(jiàn);葛根素組骨痂組織可見(jiàn)較多骨小梁,骨小梁生長(zhǎng)較旺盛,排列有序,可見(jiàn)較多成熟的骨細(xì)胞,新生小血管較多。去勢(shì)組血管數(shù)顯著低于假手術(shù)組(P<0.05),葛根素組血管數(shù)顯著高于去勢(shì)組(P<0.05)。見(jiàn)圖2和表3。

        圖2 觀察骨痂組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化(×200) A:假手術(shù)組;B:去勢(shì)組;C:葛根素組。Fig.2 Observation of the morphological changes of the epiphysis (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

        表3 各組大鼠骨痂組織血管計(jì)數(shù)比較Table 3 Comparison of blood vessel counts of osteophytes among each group

        2.4 骨痂BMP-2和VECF表達(dá)

        BMP-2定位于成骨細(xì)胞胞漿及骨小梁的邊緣,VEGF定位于成骨細(xì)胞胞質(zhì)及少量成熟軟骨細(xì)胞,陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色。去勢(shì)組較假手術(shù)組BMP-2和VEGF陽(yáng)性表達(dá)均顯著降低(P<0.05),葛根素組較去勢(shì)組BMP-2和VEGF陽(yáng)性表達(dá)均顯著增高(P<0.05)。見(jiàn)圖3、圖4和表4。

        圖3 觀察骨痂組織BMP-2表達(dá)(×200) A:假手術(shù)組;B:去勢(shì)組;C:葛根素組。Fig.3 Observation of the expression of BMP-2 in osteophyte (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

        圖4 觀察骨痂組織VEGF表達(dá)(×200) A:假手術(shù)組;B:去勢(shì)組;C:葛根素組。Fig.4 Observation of the expressions of VEGF in osteophytes (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

        表4 各組大鼠骨痂組織BMP-2和VECF表達(dá)比較Table 4 Comparison of expressions of BMP-2 and VEGF in osteophytes among rats in each group

        3 討論

        OP是中老年人的常見(jiàn)病、多發(fā)病,嚴(yán)重危害老年人的健康[8]。OPF作為OP最嚴(yán)重的并發(fā)癥,因其治療較正常骨折困難,且易于發(fā)生二次骨折,是臨床骨科的一大難題[9]。隨著我國(guó)人口的老齡化的加劇,OP和OPF的發(fā)病率逐漸上升,給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。

        婦女絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平下降是引起絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的主要原因,雌激素代替療法(ERT)可預(yù)防治療OP[10]。雌激素可促進(jìn)骨小梁生成和加速骨折的愈合,但是長(zhǎng)期應(yīng)用雌激素卻能帶來(lái)很多不良反應(yīng)(如子宮內(nèi)膜癌、血栓栓塞性疾病)[11]。葛根素是一種異黃酮衍生物,屬于植物雌激素,其結(jié)構(gòu)類似雌二醇,具有某些雌激素樣作用,目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于治療心腦血管疾病等[12]。葛根素通過(guò)與雌激素受體(ER)結(jié)合能增強(qiáng)成骨細(xì)胞的增殖與分化,促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化功能,增加骨密度和骨強(qiáng)度,具有抗骨吸收、促進(jìn)骨形成[13-15]。同時(shí)有研究表明也葛根素可以調(diào)節(jié)去卵巢大鼠OPF骨代謝,促進(jìn)骨形成,加快骨折愈合[16]。

        血管生成在骨發(fā)育、骨折愈合中起著重要作用。血管生成能提供骨愈合所需要的營(yíng)養(yǎng)及各種成骨細(xì)胞成分,新生血管系統(tǒng)在骨發(fā)育、重塑、骨折修復(fù)和穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)目前作為最重要的促血管生長(zhǎng)因子,能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成[17]。VEGF在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、滲透等方面起著重要調(diào)節(jié)作用,其誘導(dǎo)血管生成可促進(jìn)骨再生與修復(fù)[18]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是最強(qiáng)有力的骨誘導(dǎo)劑,BMP能誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化為成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞,促進(jìn)新骨形成,其中尤以BMP-2作用最顯著,BMP-2通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活其下游信號(hào)分子促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和誘導(dǎo)成骨的能力。

        本研究表明去勢(shì)組較假手術(shù)組骨折愈合評(píng)分、血清BMP-2和VEGF濃度、骨痂BMP-2和VEGF表達(dá)、微血管數(shù)均顯著降低(P<0.05),葛根素組較去勢(shì)組上述指標(biāo)均顯著增高(P<0.05)。去勢(shì)組骨痂組織可見(jiàn)少量骨小梁,生長(zhǎng)稀疏,排列紊亂,間隙增寬,大量纖維軟骨細(xì)胞等纖維組織,成骨細(xì)胞及新生小血管少見(jiàn);葛根素組骨痂組織為大量成熟骨組織,骨小梁生長(zhǎng)旺盛,互相交錯(cuò)網(wǎng)狀,排列致密有序,較多成骨細(xì)胞,新生小血管較多。說(shuō)明葛根素通過(guò)促進(jìn)去卵巢大鼠OPF骨痂組織BMP-2和VEGF表達(dá),促進(jìn)骨痂血管形成,進(jìn)而加快骨折愈合。周雪明等[19]研究發(fā)現(xiàn)葛根素能改善骨折后的骨和骨骼肌的血流量。田發(fā)明等[20]研究發(fā)現(xiàn)仙靈骨葆可促進(jìn)去卵巢大鼠OPF血管形成,促進(jìn)骨折早期愈合。

        綜上所述,葛根素通過(guò)介導(dǎo)去卵巢大鼠OPF骨痂BMP-2和VEGF表達(dá),促進(jìn)骨痂血管形成,改善骨組織形態(tài)學(xué),加快骨折愈合。當(dāng)然本實(shí)驗(yàn)研究?jī)H是初步結(jié)果,但其具體作用機(jī)制目前尚未完全清楚,還有待于進(jìn)一步研究。因此,探討中西結(jié)合防治OP是未來(lái)研究的重點(diǎn),同時(shí)也為中草藥的應(yīng)用開(kāi)辟了新的途徑。

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