王劍 劉劍輝 李屹 王實(shí) 劉研 豐雪妮 劉永林 劉文艷 宋光熠 鄭洪新
1.遼寧省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,遼寧 沈陽 1101012.遼寧中醫(yī)藥大學(xué),遼寧 沈陽 110847
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是原發(fā)性骨質(zhì)疏松Ⅰ型,特征為骨量減少、顯微結(jié)構(gòu)退化、脆性增高,臨床常表現(xiàn)為腰背酸痛、駝背、變矮、易骨折,直接原因是女性絕經(jīng)后雌激素水平下降導(dǎo)致骨重建失衡,中醫(yī)藥防治療效肯定,但作用機(jī)制不清楚。近年研究發(fā)現(xiàn),表觀遺傳調(diào)控重要組成之一的DNA甲基化通過調(diào)控骨質(zhì)疏松相關(guān)基因的表達(dá),影響骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展[1]。本研究以成骨細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用的遠(yuǎn)端缺失同源盒5(distal-less homeobox 5,Dlx5)[2]基因啟動(dòng)子甲基化水平為效應(yīng)指標(biāo),探索基于中醫(yī)“腎主骨”理論指導(dǎo)的補(bǔ)腎中藥復(fù)方的療效機(jī)理,為中醫(yī)藥防治PMOP提供表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
SPF級(jí)Wistar雌性(未曾交配)大鼠61只,3月齡,體質(zhì)量(240±20)g,購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司(遼寧省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心),許可證號(hào):SCXK(遼)2015-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于遼寧省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥理實(shí)驗(yàn)室(國家中醫(yī)藥管理局二級(jí)實(shí)驗(yàn)室),室溫20 ℃~25 ℃,相對(duì)濕度35%~65%,喂以大小鼠維持飼料(遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司)。
大鼠購進(jìn),適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后,完全隨機(jī)分出12只為正常組,余者行雙側(cè)卵巢摘除術(shù):3%戊巴比妥鈉腹腔注射(35 mg/kg)麻醉,腹部切口摘除雙側(cè)卵巢。術(shù)者完全隨機(jī)分為模型組12只、補(bǔ)腎中藥復(fù)方組18只、仙靈骨葆陽性對(duì)照組19只。灌胃期間,仙靈骨葆陽性對(duì)照組大鼠死亡1只,取材大鼠共計(jì)60只。
1.3.1實(shí)驗(yàn)藥品:補(bǔ)腎中藥復(fù)方:馬鹿茸凍干粉(遼寧宏宇生物科技有限公司)、淫羊藿顆粒(規(guī)格:顆粒100 g相當(dāng)于飲片2 100 g,四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司)、納米牡蠣殼微粉(平均粒徑780 nm,長山島大連灣);陽性對(duì)照藥仙靈骨葆膠囊[由淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補(bǔ)骨脂、地黃組成,國藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字Z20025337,批號(hào)180417]。
1.3.2給藥劑量與方法:大鼠等效劑量按成人(體質(zhì)量60 kg)6.3倍計(jì)算,給藥容積:1 mL/100 g。正常組和模型組給生理鹽水;補(bǔ)腎中藥復(fù)方組給補(bǔ)腎中藥復(fù)方[馬鹿茸凍干粉0.315 g/(kg·d)、淫羊藿顆粒0.15 g/(kg·d)、納米牡蠣殼微粉1.05 g/(kg·d)];仙靈骨葆陽性對(duì)照組給仙靈骨葆膠囊粉0.315 g/(kg·d)。術(shù)后6 d開始,每日灌胃1次(每灌6 d,休息1 d不灌),連續(xù)14周。
X射線骨密度測(cè)定儀(STRATOS DR,Diagnostic Medical System SA,法國)、MassARRAY Nanodispenser(RS1000,SEQUENOM)、S1000TM Thermal Cycler(384孔,BIORAD)、PCR儀(96孔,BIORAD)等。
QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN,51304)、PCR Accessory Set(SEQUENOM,11327)、EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO,D5005)、MassCLEAVE Kit(SEQUENOM,10129.1)、Spectro CHIP?Arrays and Clean Resin Kit(SEQUENOM,10117)等。
1.6.1骨密度(bone mineral density,BMD):取第1~6腰椎,剔除附著之軟組織,用生理鹽水沖洗,包以生理鹽水浸濕的醫(yī)用紗布,外包錫紙,寫好編號(hào),-80 ℃冰箱凍存。應(yīng)用X射線骨密度測(cè)定儀(STRATOS DR)檢測(cè)大鼠離體第1~6腰椎骨密度,精細(xì)模式掃描,用儀器附帶的DMS小動(dòng)物骨密度分析軟件(版本:V4.0.7.1)分析骨密度值,以單位面積的骨礦含量(g/cm2)表示。
1.6.2Dlx5啟動(dòng)子甲基化水平:取雙側(cè)股骨頭,剔除附著之軟組織,用生理鹽水沖凈血污,無菌吸水紙吸干,裝入對(duì)應(yīng)編號(hào)的液氮凍存管,擰緊管蓋,液氮速凍0.5 h后,-80 ℃冰箱凍存。質(zhì)譜法檢測(cè):①引物設(shè)計(jì):檢測(cè)片段:Dlx5基因啟動(dòng)子-470 bp至-4 bp(序列:GCAGGCTGACTGTTGGCTGAGGCGCA GCACAGCCTTGGTTAAATCCTTAATTGCGCGCTTA CGCACAGCGGGGTGGATCGGGTTCCATTGGCCAG GGCCTCGGGAGCAGAGCAACACCCTAACTCGTTC AACTAGTTTTAGCACAACAAAGCATTGCTTAAAA AAGAGAGAGGGGGGGGGCGTACAAGGAGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG AGAGAGAGAGAGAGAGTGTGTGTGTGTGTGTGAG AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACTG TACGTGTTGTTGCCTGTTGGGGGAGGCAGGGTCTC AGTCGATCTGTTTTTAGTGAATAGCTGCTACAAAT CAAGCAGTTCCAGGGCCCAGCTCTGTGCTGTT),長度467 bp,CpG位點(diǎn)總數(shù)11個(gè),能檢測(cè)到10個(gè)CpG位點(diǎn)。引物設(shè)計(jì)使用 Sequenom 公司 Epidesigner(http://www.epidesigner.com),修飾后的上游引物:aggaagagagGTAGGTTGATTGTTGGTTGAGG,修飾后的下游引物:cagtaatacgactcactatagggagaaggct AACAACACAAAACTAAACCCTAAAA。引物設(shè)計(jì)完成后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。②DNA提?。菏褂肣IAamp DNA Mini Kit(QIAGEN)試劑盒提取骨組織DNA。③重亞硫酸鹽處理:使用PCR儀(96孔,BIORAD)、EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO)試劑盒對(duì)DNA樣品進(jìn)行重亞硫酸鹽處理,使未甲基化的C轉(zhuǎn)變?yōu)閁,甲基化的C不變。PCR儀程序:98 ℃,10 min→64 ℃,2.5 h→4 ℃,forever。④PCR擴(kuò)增:使用S1000TM Thermal Cycler(384孔,BIORAD)、PCR Accessory Set(SEQUENOM)試劑盒和步驟①設(shè)計(jì)合成的引物擴(kuò)增重亞硫酸鹽處理后的樣品。PCR程序:94 ℃,10 min;(94 ℃,45 s;62 ℃,48 s,-0.5 ℃/cycle;72 ℃,1 min)10cycles;(94 ℃,45 s;57 ℃,48 s;72 ℃,1 min)35cycles;72 ℃,3 min;4 ℃,forever。⑤堿性磷酸酶處理(SAP):使用S1000TM Thermal Cycler(384孔,BIORAD)、MassCLEAVE Kit(SEQUENOM)試劑盒處理步驟④的PCR產(chǎn)物。PCR儀程序:37 ℃,20 min→85 ℃,5 min→4 ℃,forever。⑥體外轉(zhuǎn)錄(IVT)和RNase酶切:使用S1000TM Thermal Cycler(384孔,BIORAD)、MassCLEAVE Kit(SEQUENOM)試劑盒將SAP處理后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和RNase酶切。PCR儀程序:37 ℃,3 h→4 ℃,forever。⑦純化,點(diǎn)樣及質(zhì)譜:使用Spectro CHIP?Arrays and Clean Resin Kit(SEQUENOM)試劑盒。先將酶切產(chǎn)物純化,再用MassARRAY Nanodispenser(RS1000,SEQUENOM)將純化產(chǎn)物點(diǎn)至384格式 Spectro CHIP (SEQUENOM)芯片上,將芯片放入MassARRAY Compact System (SEQUENOM)檢測(cè)。Spectro CHIP 芯片使用 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析技術(shù),檢測(cè)數(shù)據(jù)用 EpiTYPER 軟件(SEQUENOM)分析并輸出結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜法檢測(cè)甲基化由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成。
與正常組比較,模型組第1~6腰椎骨密度明顯降低(P<0.01);與模型組比較,補(bǔ)腎中藥復(fù)方組、仙靈骨葆陽性對(duì)照組第1~6腰椎骨密度明顯升高(P<0.05);補(bǔ)腎中藥復(fù)方組比仙靈骨葆陽性對(duì)照組第1~6腰椎骨密度有升高趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。
表1 各組大鼠離體第1~6腰椎骨密度Table 1 BMD of the rat lumbar vertebra 1-6 in each
甲基化檢測(cè)每組隨機(jī)抽取8個(gè)樣本送檢,共計(jì)32個(gè)樣本,補(bǔ)腎中藥復(fù)方組有1個(gè)樣本PCR失敗了,故31個(gè)樣本上質(zhì)譜分析。Dlx5基因啟動(dòng)子檢測(cè)片段-470 bp至-4 bp含有CpG位點(diǎn)11個(gè),位點(diǎn)4未檢測(cè)到,檢測(cè)到10個(gè)CpG位點(diǎn),位點(diǎn)11正常組有2個(gè)樣本沒分析出來。
與正常組比較,模型組CpG2.3甲基化水平明顯升高(P<0.01),模型組CpG1、CpG5、CpG6、CpG7、CpG8、CpG9、CpG10甲基化水平有升高趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組比較,補(bǔ)腎中藥復(fù)方組、仙靈骨葆陽性對(duì)照組CpG1甲基化水平明顯降低(P<0.05),補(bǔ)腎中藥復(fù)方組CpG2.3、CpG5、CpG6、CpG7、CpG10、CpG11甲基化水平有降低趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),仙靈骨葆陽性對(duì)照組CpG8、CpG10、CpG11甲基化水平有降低趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表2。
表2 各組大鼠骨組織Dlx5基因啟動(dòng)子-470 bp至-4 bp甲基化水平Table 2 Methylation level of Dlx5 gene promoter -470 bp - -4 bp in bone of rats in each
表觀遺傳是研究基因序列不發(fā)生改變的情況下,產(chǎn)生基因表達(dá)的可遺傳變化。表觀遺傳修飾是一種重要的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制,包括DNA甲基化、組蛋白修飾(甲基化、乙酰化、磷酸化等)、非編碼RNA和微小RNA(microRNA)、染色質(zhì)重塑等。近年研究表明,DNA甲基化、組蛋白修飾、microRNA可調(diào)控多種成骨、破骨相關(guān)基因的表達(dá),從而影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化和活性,參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展[3]。DNA甲基化是重要的表觀遺傳修飾之一,在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下,以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)為甲基供體,將其活性甲基轉(zhuǎn)移到5’-CpG-3’二核苷酸的胞嘧啶第5位碳原子上,是可逆的DNA自然化學(xué)修飾方式。啟動(dòng)子序列DNA甲基化抑制基因表達(dá)[2],甲基化DNA與甲基化胞嘧啶結(jié)合蛋白(methylcytosine binding proteins,MeCP)結(jié)合,誘導(dǎo)染色質(zhì)組蛋白脫乙?;瑯?gòu)象改變,抑制基因轉(zhuǎn)錄[4]。第1外顯子甲基化沉默轉(zhuǎn)錄[5],可能因?yàn)榈?外顯子甲基化阻礙轉(zhuǎn)錄起始?;蝮w甲基化與基因表達(dá)水平呈正相關(guān),可能因?yàn)榛蝮wDNA甲基化抑制基因內(nèi)啟動(dòng)子啟動(dòng)的假轉(zhuǎn)錄,從而實(shí)現(xiàn)5’基因啟動(dòng)子啟動(dòng)的有效轉(zhuǎn)錄[2]。Delgado-Calle等[6]研究骨質(zhì)疏松性髖部骨折和髖關(guān)節(jié)炎患者骨全基因組甲基化譜,發(fā)現(xiàn)兩組患者中:甲基化與基因表達(dá)之間存在全基因組負(fù)相關(guān);甲基化差異顯著的CpG位點(diǎn)共241個(gè),分布于228個(gè)基因中,差異甲基化基因多為與細(xì)胞分化和成骨相關(guān)的基因,例如同源盒(homeobox,Hox)家族的基因,說明骨質(zhì)疏松發(fā)病可能與這些基因甲基化改變相關(guān)。
同源盒超家族基因不僅在胚胎發(fā)生過程中對(duì)骨骼結(jié)構(gòu)起重要作用,而且還影響成骨細(xì)胞的分化和活性[6]。Dlx5屬于同源盒基因家族,通過調(diào)控靶基因Runx2、骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋蛋白、I型膠原轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,礦化骨基質(zhì)[7-10],對(duì)防治骨質(zhì)疏松癥意義重大。張志恒等[11]研究表明,健骨顆粒能明顯升高去卵巢小鼠骨組織Dlx5 mRNA和蛋白表達(dá),有效防治骨質(zhì)疏松。本課題組前期研究表明,去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低,補(bǔ)腎壯骨中藥復(fù)方可明顯上調(diào)之,有效防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[12]。Zhang等[13]研究表明,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-CdR)上調(diào)Dlx5表達(dá),說明Dlx5 DNA甲基化負(fù)調(diào)控其表達(dá)。Novakovic等[14]研究表明,妊娠期間Dlx5甲基化與其mRNA表達(dá)負(fù)相關(guān)。那么,去卵巢導(dǎo)致的骨組織Dlx5表達(dá)下降是否與其異常甲基化有關(guān),補(bǔ)腎中藥是否通過調(diào)節(jié)其甲基化而上調(diào)其表達(dá),Dlx5異常甲基化是否與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病有關(guān)呢?
本研究基于中醫(yī)“腎主骨”理論,依據(jù)PMOP“腎虛”的根本病機(jī)[12],組補(bǔ)腎中藥復(fù)方(鹿茸為君,壯腎益精、強(qiáng)筋健骨;淫羊藿為臣,補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨;佐以牡蠣,補(bǔ)腎、強(qiáng)骨節(jié)、潛陽補(bǔ)陰),補(bǔ)腎以健骨,以臨床治療骨質(zhì)疏松癥療效確切的同濟(jì)堂仙靈骨葆膠囊(由淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補(bǔ)骨脂、地黃組成,功效滋補(bǔ)肝腎、接骨續(xù)筋、強(qiáng)身健骨)為陽性對(duì)照藥,以骨組織Dlx5基因啟動(dòng)子-470 bp至-4 bp甲基化水平為效應(yīng)指標(biāo),探究PMOP的發(fā)病機(jī)制以及補(bǔ)腎中藥復(fù)方的療效機(jī)理。本研究采用經(jīng)典方法切除雌性大鼠雙側(cè)卵巢建立PMOP動(dòng)物模型[15]。結(jié)果顯示,模型組大鼠第1~6腰椎骨密度比正常組明顯降低,骨組織Dlx5啟動(dòng)子-470 bp至-4 bp CpG2.3甲基化水平比正常組明顯升高。說明PMOP模型建立成功,去卵巢造成骨組織Dlx5啟動(dòng)子高甲基化,甲基化DNA與甲基化胞嘧啶結(jié)合蛋白結(jié)合,誘導(dǎo)染色質(zhì)組蛋白脫乙?;?,構(gòu)象改變,抑制其轉(zhuǎn)錄,下調(diào)其表達(dá),進(jìn)而下調(diào)其靶基因Runx2、骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋蛋白、I型膠原的表達(dá),抑制成骨細(xì)胞分化和成骨,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。補(bǔ)腎中藥復(fù)方組、仙靈骨葆陽性對(duì)照組第1~6腰椎骨密度比模型組明顯升高,骨組織Dlx5 啟動(dòng)子-470 bp至-4 bp CpG1甲基化水平比模型組明顯降低。說明本研究補(bǔ)腎中藥復(fù)方和仙靈骨葆可有效防治PMOP,通過降低去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Dlx5啟動(dòng)子甲基化水平,降低甲基化DNA與甲基化胞嘧啶結(jié)合蛋白結(jié)合,染色質(zhì)組蛋白乙?;?,賴氨酸殘基掉正電荷,降低組蛋白與帶負(fù)電荷的DNA的結(jié)合,促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄,上調(diào)其表達(dá),進(jìn)而上調(diào)其靶基因Runx2、骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋蛋白、I型膠原的表達(dá),促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和成骨,有效防治PMOP。從而證明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制之一可能是骨組織Dlx5啟動(dòng)子甲基化水平升高;補(bǔ)腎中藥復(fù)方可能通過降低骨組織Dlx5 啟動(dòng)子甲基化水平,有效防治該病。