劉永紅 陳遠明 周昊楠 黃中飛 王珣

1.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院預(yù)防保健科，廣西 南寧 5300072.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，廣西 南寧 5300073.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院骨科，廣西 南寧 530000

雌激素水平下降是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的主要原因[1]。在臨床上，發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者有一共同現(xiàn)象，即出現(xiàn)椎體骨小梁明顯下降以及脂肪明顯增加。因此，筆者推測是不是絕經(jīng)影響了某種干細胞的分化，從而導(dǎo)致成骨減少以及成脂肪增加？有研究發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)既可以向成骨分化，又可以向成脂肪分化[2]。女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平明顯下降[3]，這是否影響脂肪干細胞的分化？雌激素減少引起骨質(zhì)疏松[4]，但其機制尚有爭議，多數(shù)學(xué)者認為是通過破骨細胞的作用[5-7]。雌激素可以治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，但有誘發(fā)乳腺癌、增加腦血管意外和靜脈血栓栓塞事件的風(fēng)險[8]。葛根素是從豆科植物野葛或甘葛藤的根中提取得到的異黃酮類化合物，屬于植物類激素，與雌激素有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，具有一定的抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松作用[9-14]，但其作用機理目前尚不明確。本實驗試圖通過體外觀察葛根素誘導(dǎo)卵巢切除后大鼠骨質(zhì)疏松模型的ADSCs成骨分化的能力，評價葛根素抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松效果，旨在開發(fā)新的治療骨質(zhì)疏松的藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

雌性3月齡SD大鼠，體重(250±25)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，醫(yī)學(xué)實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(桂)2016-0002。葛根素，產(chǎn)品規(guī)格：20 mg(北京索寶生物科技有限公司提供)。大鼠抗體CD45、CD44、CD29、CD11B、CD90，產(chǎn)品規(guī)格：50 μg、0.1 mg、50 μg、50 μg、50 μg(美國BD公司提供)。堿性磷酸酶染色試劑盒，產(chǎn)品規(guī)格：50 T(上?？道噬锟萍加邢薰咎峁?； 堿性磷酸酶活性檢測試劑盒，產(chǎn)品規(guī)格：100 T(上海翊圣生物科技有限公司提供)。茜素紅染色試劑盒，solarbio，貨號G1452-100 mL(北京索萊寶科技公司提供)。

1.2 方法

1.2.1絕經(jīng)后大鼠 ADSCs的分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定：取飼養(yǎng)3個月后的SD大鼠，采用3%的戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g通過腹腔注射方式麻醉大鼠，剔除腹部毛發(fā)，以碘伏常規(guī)消毒，沿腹中線作0.8～1 cm切口，深達腹腔，用鑷子輕輕牽起腹腔內(nèi)組織，找到兩側(cè)輸卵管結(jié)合處，分別沿輸卵管找到兩側(cè)卵巢，用電凝筆切開輸卵管卵巢結(jié)合處并切除卵巢及少許周圍脂肪，觀察無滲血后，將輸卵管還納腹腔，由內(nèi)向外逐層縫合腹肌和皮膚，取暖器照射復(fù)蘇，待大鼠蘇醒后送回籠中。術(shù)后6 h恢復(fù)常規(guī)飲食，腹腔注射抗生素，持續(xù)一周，傷口處涂抹紅霉素軟膏，預(yù)防感染。

術(shù)后飼養(yǎng)3個月后，采用3%的戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g通過腹腔注射方式麻醉大鼠，75%酒精紗布濕敷10 min后，無菌條件下取腹股溝處脂肪置于培養(yǎng)皿，剔除肉眼可見的小血管、包膜及結(jié)締組織，PBS清洗3次去除紅細胞，眼科剪持續(xù)剪5～8 min，將脂肪組織剪成1 mm3左右大小組織塊，沖洗干凈，轉(zhuǎn)移至離心管，加入2倍體積的0.075% I型膠原酶，放置在恒溫搖床，37 ℃、150 r/min振蕩消化1 h；加入等體積完全培養(yǎng)基(低糖DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL鏈霉素)中止消化，200目濾網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心10 min；去除上清及殘留未消化組織；加入完全培養(yǎng)液輕柔吹打，重懸細胞，接種于25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，輕晃混勻，細胞培養(yǎng)箱設(shè)置為飽和濕度，5%C02，37 ℃標準條件。24 h后首次換液，除去未貼壁細胞，之后每2 d換液1次。

傳代培養(yǎng)：顯微鏡下觀察細胞，當細胞長滿培養(yǎng)瓶底70%～80%后，開始傳代。在超凈工作臺內(nèi)吸出培養(yǎng)基，加入1 mL的0.25%胰蛋白酶，輕柔晃動培養(yǎng)瓶使胰酶均勻覆蓋瓶底，在顯微鏡下觀察到大部分細胞回縮后，拍打瓶身松散細胞，加入完全培養(yǎng)基中止消化，吹打瓶底，轉(zhuǎn)移至離心管，1 000 r/min離心5 min；去除上清，加入完全培養(yǎng)基，輕柔吹打，重懸細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至另外兩個新的25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，輕柔晃動使細胞均勻鋪滿瓶底。通常5～7 d后可再次長滿瓶底70%～80%，同樣的方法進行傳代，顯微鏡下觀察ADSCs的形態(tài)。

鑒定：分別取第3代和第21代卵巢切除組的ADSCs行免疫熒光化學(xué)染色，一抗為 CD11b、CD29、CD45、CD44、CD90，陰性對照組加入PBS代替一抗對照，步驟如下：(1)細胞計數(shù)后取105個細胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清液。(2)加入50 μL PBS重懸，按以下分組加入免疫熒光染料： A：5 μL PE-CD90，5 μL FITC-CD29，5 μL APC-CD11b，5 μL PE-Cy7-CD45；B：5 μL PE-CD90，5 μL FITC-CD44，5 μL APC-CD11b，5 μL PE-Cy7-CD45；C：20 μL PBS。(3)將細胞與抗體用移液器輕柔混勻，室溫下避光孵育30 min。(4)每組加入1 mL PBS，1 200 r/min離心5 min，棄上清液。(5)加入500 μL PBS重懸后，使用流式細胞儀進行檢測，比較差異，分析結(jié)果。

1.2.2測定葛根素的無毒劑量：取第3代對數(shù)生長期的ADSCs，0.25%胰酶消化，完全培養(yǎng)基中止消化，1 000 r/min離心5 min，再加入完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至1×107個/L，種入96孔板，200 μL/孔，在飽和濕度、37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，換液除去未貼壁的細胞。實驗組分別加入濃度為0.25、0.5、1、1.5、3、6、12、25、50、100 mmol/L的含葛根素培養(yǎng)基各20 μL，然后加入含胎牛血清10%的培養(yǎng)基180 μL，對照孔不加藥物，只加200 μL培養(yǎng)基作為空白對照，培養(yǎng)72 h，加入5 g/L的MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，吸去上清，每孔加入150 μL的二甲基亞砜，使用酶標儀檢測570 nm吸光度(A)值。用統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，最后取4個復(fù)孔的平均值，計算細胞破壞百分率，破壞率(%)={[A(細胞組)-A(給藥組)]/[A(細胞組)-A(空白組)]}×100%。破壞率<5%的藥物濃度視為無毒劑量。

1.2.3測定葛根素的最大有效濃度：將0.1%明膠加入6孔板中，輕輕搖勻使其完全覆蓋各孔的底面，在超凈工作臺中靜置30 min，用移液器吸除各孔的液體，晾干備用。將培養(yǎng)的第3代卵巢切除大鼠ADSCs懸液以1×105個/孔接種于6孔板，加入含10%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)基5 mL/孔，培養(yǎng)24 h后，設(shè)計葛根素實驗組、陰性對照組及陽性對照組。根據(jù)所測定的無毒劑量結(jié)果，配制高、中、低3個濃度葛根素實驗組。換液時，陰性對照組僅更換培養(yǎng)基，葛根素實驗組更換含有不同濃度的葛根素培養(yǎng)基，陽性對照組更換為雌二醇1×10-4mmol/L培養(yǎng)基，3 d換液 1次。按上述設(shè)計共計5組，每組3孔，共15孔。

將ADSCs接種于上述同樣方法處理的6孔板中，誘導(dǎo)培養(yǎng)至第7天后進行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色。依次加入堿性磷酸酯酶染色緩沖液10 mL，BCIP溶液(300×) 33 μL，NBT溶液(150×) 66 μL，混勻后即配制成10.1 mL堿性磷酸酶染色工作液。移液器吸除6孔板中的培養(yǎng)基，PBS液輕柔沖洗3遍，加入1 mL堿性磷酸酶染色工作液，輕柔晃動，確保底部細胞能被染色液均勻覆蓋。室溫避光孵育1 h。吸除工作液，PBS液沖洗2遍，終止顯色反應(yīng)。最后顯微鏡下觀察染色效果，拍攝記錄。

將ADSCs接種于上述同樣方法處理的6孔板中，誘導(dǎo)培養(yǎng)至第21天后進行茜素紅染色。移液器吸除6孔板中的培養(yǎng)基，PBS液輕柔沖洗3次；加入2 mL/孔4%多聚甲醛溶液，固定30 min，吸除多聚甲醛溶液，PBS沖洗3遍；加入2 mL/孔茜素紅染液，5 min后吸除茜素紅染液，PBS沖洗3遍，顯微鏡下觀察染色效果，并拍攝記錄。

ALP活性檢測：采用ALP底物試劑盒測定ALP的表達。在加入葛根素后5、7、10、12 d后的4個時間點進行檢測。取一管顯色底物，溶于2.5 mL的ALP反應(yīng)緩沖液，充分溶解混勻，冰上放置。取出10 mmol/L的p-nitrophenol標準品溶液10 μL，加ALP反應(yīng)緩沖液稀釋至0.2 mL，得到最終濃度為0.5 mmol/L的標準品。取出待檢測的96孔板，移液器吸除孔內(nèi)的培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，加細胞裂解液裂解細胞。將96孔板置于振蕩儀上振蕩90 s，37 ℃孵育20 min，加入100 μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，再將96孔板振蕩90 s后，用分光光度計在415 nm波長下計數(shù)并記錄，分析各組結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs鑒定(表1、圖1)

表1 雙側(cè)卵巢切除大鼠第3代ADSCs(P3)與第21代細胞(P21)的表型抗原鑒定Table 1 Phenotypic antigen identification of the third generation ADSCs (P3) and the 21st generation cells (P21) in bilateral ovariectomy rats

圖1 通過流式細胞技術(shù)對卵巢切除大鼠ADSCs的第3代和第21代進行表面抗體鑒定的對比分析Fig.1 Flow cytometry was used to identify the surface antibodies of the third and the 21st generation of ADSCs in ovariectomized rats

2.2 葛根素最大無毒劑量測定

使用含不同濃度葛根素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，測得數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)葛根素抑制細胞增殖的作用隨濃度升高而增強，12 mmol/L為無毒劑量的上限，細胞破壞率少于5%(圖2)。

圖2 無毒劑量測定Fig.2 Non-toxic dosimetry

2.3 最大有效濃度的測定結(jié)果

配制葛根素12 mmol/L高濃度組、1.5 mmol/L中濃度組、0.25 mmol/L低濃度組3組以及無葛根素的陰性對照組共4組培養(yǎng)液。4組培養(yǎng)7 d后進行堿性磷酸酶染色，可以觀察到葛根素3組有明顯藍色，且差異顯著，而陰性對照組無明顯藍色(圖3)；4組培養(yǎng)21 d后進行茜素紅染色，可以觀察到葛根素組有明顯紅色礦化結(jié)節(jié)且差異顯著，而陰性對照組無明顯紅色(圖4)。

圖3 堿性磷酸酶染色Fig.3 ALP staining

圖4 茜素紅染色Fig.4 Alizarin red staining

通過ALP活性測定，發(fā)現(xiàn)葛根素可以顯著影響ALP活性，且與時間和劑量成正相關(guān)性，而陰性對照組ALP活性與時間無明顯相關(guān)。在葛根素低濃度組和中濃度組中，ALP活性隨時間的延長而增強；葛根素高濃度組ALP活性在前期隨著時間的增加而增強，但在第12天和第10天無明顯差異(圖5)。

圖5 細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性Fig.5 Intracellular alkaline phosphatase activity

上述結(jié)果表明，葛根素12 mmol/L為誘導(dǎo)絕經(jīng)后SD大鼠脂肪干細胞成骨分化的最大有效無毒劑量。

3 討論

雌激素治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的療效已得到明確，但具有一定局限性。葛根素是植物類雌激素，與雌激素相似又不完全相同，具有抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松作用，副作用又較雌激素低，可能是一種較好的抗骨質(zhì)疏松藥物[15]。本實驗明確葛根素具有較強誘導(dǎo)脂肪干細胞向成骨分化作用，且與時間和濃度具有一定的正相關(guān)性。在SD大鼠體外實驗顯示，12 mmol/L為最佳濃度，為以后開發(fā)利用葛根素抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供了理論依據(jù)。筆者前期實驗發(fā)現(xiàn)，葛根素能抑制去卵巢大鼠骨量的丟失，有較好的骨代謝調(diào)節(jié)作用[9-10, 12-13]，對子宮等其他器官影響不明顯[11]，對雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松癥可能有一定的治療作用，這與其他學(xué)者的研究結(jié)論一致。葛根素是20世紀50年代末從葛根中分離出來的主要生物活性成分，它可以在普通食品中獲得，也可用于替代醫(yī)學(xué)，對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨質(zhì)疏松、肝損傷、體內(nèi)外炎癥均有保護作用[16]。韓國學(xué)者通過高效液相色譜法分析，從野葛根或葛根藤提煉出來的異黃酮類有葛根素(7.5%)、大豆苷(4.2%)和染料木苷(1.9%)，主要成分為葛根素。他們的實驗發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松模型(卵巢切除)組經(jīng)過4周的葛根喂養(yǎng)，可明顯增加股骨的骨密度，血漿17-雌二醇濃度會顯著升高；與空白對照組相比，葛根喂養(yǎng)組沒有改變膽固醇、高密度脂蛋白或低密度脂蛋白水平，但可明顯降低甘油三酯水平，對肝臟、子宮和腹部脂肪組織的重量未受影響[17]。日本學(xué)者還發(fā)現(xiàn)，有C-糖苷的葛根素具有抵抗腸道消化的能力，可以被完整吸收利用，而染料木苷和大豆苷是有容易水解的O-糖苷；葛根素抗骨質(zhì)疏松作用不是通過雌激素的受體途徑，而大豆苷更像雌激素一樣，是通過雌激素受體發(fā)揮作用的[18]。還有學(xué)者認為葛根素可預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，其機制是對骨形成及NO/cGMP通路有促進作用，對誘導(dǎo)骨髓干細胞(hBMSC)增殖及成骨細胞分化有重要作用[19]。本實驗雖然發(fā)現(xiàn)葛根素可以誘導(dǎo)脂肪干細胞向成骨分化，但具體機制及抗骨質(zhì)疏松效果仍需進一步研究。