姚 丹, 周姝婧, 周冰峰, 徐新建, 朱翔杰

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院), 福州 350002)

蜜蜂不僅為人類提供了豐富多樣的蜂產(chǎn)品，而且是農(nóng)業(yè)中最重要的授粉昆蟲，在維護(hù)生態(tài)平衡發(fā)揮重要作用(Allen-Wardelletal., 1998)。近年來，全球氣候變化和病蟲害危害導(dǎo)致蜜蜂的種群數(shù)量大幅下降(Milbrathetal., 2015)，蜜蜂蜂群的減少引起了人們對(duì)蜜蜂健康的極大關(guān)注。

環(huán)境溫度是影響昆蟲分布、形態(tài)、生理、行為等的主要生態(tài)因素之一(Burnett, 1949; Ponsonby and Copland, 1996)。 獨(dú)居性昆蟲可通過休眠或滯育等方式耐受低溫等不良環(huán)境，生態(tài)幅一般較寬(Tauber and Tauber, 1976)。而蜜蜂的卵、蟲、蛹(統(tǒng)稱為蜂子)是在蜂群維持較穩(wěn)定的巢溫下發(fā)育的，因此形成了狹溫性特點(diǎn)，發(fā)育溫區(qū)為29～38℃，最適發(fā)育溫度為35℃(Tautzetal., 2003; Grohetal., 2004; 朱翔杰等, 2006)。偏離最適溫度，羽化后成蜂的外部形態(tài)(Medrzyckietal., 2010)、翅脈發(fā)育(周冰峰等, 2011; Zhuetal., 2018)、神經(jīng)突觸數(shù)量(Grohetal., 2004)、壽命(Wangetal., 2016)和行為(Jonesetal., 2005; Becheretal., 2009)等均受到影響。蜜蜂發(fā)育對(duì)溫度的敏感性，使得蜂子成為研究溫度對(duì)個(gè)體發(fā)育影響的理想材料，有助于認(rèn)識(shí)溫度與生命的關(guān)系。

低溫對(duì)昆蟲的影響主要表現(xiàn)在糖代謝、脂類代謝、氨基酸代謝、嘌呤代謝和硫胺素代謝等代謝通路上富集大量差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)(庫爾班·吐松等, 2016; Tangetal., 2017; Wangetal., 2017; Xuetal., 2017; Qinetal., 2019)。在0℃下20日齡中華蜜蜂Apisceranacerana成蜂轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)到與環(huán)境進(jìn)程相關(guān)的Ca2+信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路等，同時(shí)熱激蛋白、鋅指蛋白和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等差異表達(dá)(Xuetal., 2017)。

相對(duì)其他日齡的蜜蜂封蓋子，3日齡封蓋子處于幼蟲-蛹變態(tài)的過渡期，表現(xiàn)出對(duì)低溫脅迫最敏感。前期研究發(fā)現(xiàn)，不同日齡封蓋子經(jīng)20℃低溫脅迫后3日齡封蓋子最早出現(xiàn)大量封蓋子死亡，羽化蜜蜂的壽命也最短(Wangetal., 2016)。到目前為止，尚無研究對(duì)蜜蜂封蓋子發(fā)育期間低溫敏感的機(jī)制給出解釋。為了深入研究低溫對(duì)蜜蜂化蛹影響的分子機(jī)制，本研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法對(duì)低溫處理不同時(shí)間的意大利蜜蜂Apismelliferaligustica3日齡封蓋子的共有差異表達(dá)基因進(jìn)行趨勢(shì)分析，從分子水平探討蜜蜂化蛹時(shí)受低溫影響的關(guān)鍵基因和關(guān)鍵通路。本研究對(duì)豐富昆蟲生態(tài)學(xué)和昆蟲發(fā)育生物學(xué)有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試蜜蜂

樣本取自春季增長階段的意大利蜜蜂A.m.ligustica蜂群，通過限制蜂王產(chǎn)卵空間，獲得卵齡一致的蜜蜂卵。3 d后將卵脾放入同一個(gè)哺育群哺育。移入哺育群5 d后這些幼蟲即將封蓋，獲取4 h內(nèi)同時(shí)封蓋的封蓋子(封蓋巢房內(nèi)的幼蟲和蛹)，割取樣本巢脾，放入恒溫恒濕箱(35±0.2℃, RH 75%)[CTHI-250B, 施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司]中培育至3日齡(對(duì)照組，CK)。再將一部分3日齡封蓋子放入溫度20±0.2℃、RH 75%(Wangetal., 2016)的恒溫恒濕箱中分別處理18 h和36 h(分別標(biāo)記為T18和T36)，作為低溫處理組。所取的封蓋子樣本立即用液氮冷凍，放入-80℃保存?zhèn)溆?。每個(gè)樣本用30只封蓋子(3個(gè)蜂群，10頭/群)混合建庫和高通量測(cè)序。

1.2 高通量測(cè)序及測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

利用Trizol法提取1.1節(jié)樣品全蟲總RNA，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA后，加入fragmentation buffer使其片段成為短片段的mRNA為模板。用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成cDNA第1鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第2鏈，經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測(cè)序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫制備工作，構(gòu)建好cDNA文庫，高通量測(cè)序委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成，測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeqTM。對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)的raw reads進(jìn)行過濾，去除含adapter的reads、含N比例大于10%的reads和低質(zhì)量的reads，最終得到clean reads，然后利用Tophat2(2.1.1)軟件將reads比對(duì)到西方蜜蜂Apismellifera的參考基因組(ncbi_GCF_000002195.4)上，并利用Cufflinks組裝轉(zhuǎn)錄本。 轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)已上傳NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(獲取號(hào): SRR10912937-SRR10912945)。

1.3 差異表達(dá)基因趨勢(shì)分析

使用DESeq2軟件(V1.20.0)對(duì)有生物學(xué)重復(fù)的處理組與對(duì)照組間(T18vsCK, T36vsCK)基因表達(dá)量進(jìn)行差異分析(Loveetal., 2014)， DEGs篩選條件為FDR(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)≤0.05, |log2Fold change| (Fold change, FC, 指基因表達(dá)水平的變化倍數(shù), FC=T/CK，其中T為處理組的基因表達(dá)水平， CK為對(duì)照組的基因表達(dá)水平)≥1。利用STEM(Short Time-series Expression Miner)，選擇參數(shù){-pro 20 -ratio 1.0[log2(2)=1, log2(1.5)=0.5849625, log2(1.2)=0.2630344]}(Ernst and Bar-Joseph, 2006),對(duì)2個(gè)比較組間共有的差異表達(dá)基因進(jìn)行趨勢(shì)分析，在軟件中設(shè)置P≤0.05為差異顯著的表達(dá)模式。

1.4 差異表達(dá)基因GO及KEGG pathway富集分析

對(duì)各個(gè)趨勢(shì)中的基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝通路進(jìn)行功能注釋(Omicshare tools, http:∥www.omicshare. com/tools/home/index/index.html)，并通過假設(shè)檢驗(yàn)計(jì)算得到P值。得到的P值通過FDR校正之后，以P值≤0.05為閾值，滿足此條件的GO條目(term)和通路(pathway)定義為在該趨勢(shì)中顯著富集的GO term和Pathway。

1.5 RT-qPCR基因驗(yàn)證

隨機(jī)挑選5個(gè)趨勢(shì)顯著的基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,β-actin為內(nèi)參基因(引物見表1)。利用RNA抽提試劑盒提取樣本總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。以上述的cDNA作為模板進(jìn)行qPCR，反應(yīng)體系(20 μL): H2O 6.6 μL, 2×TransStart SuperMix 10 μL, 上下游引物(5 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL,Dye II 0.4 μL。qPCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性4 min; 95℃變性15 s, 60℃退火和延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線默認(rèn)系統(tǒng)程序(QuantStudio5, 美國)。樣本取自1.1節(jié)，對(duì)照組和處理組的封蓋子均來自3個(gè)蜂群，每個(gè)蜂群取1頭進(jìn)行混合提取總RNA。每個(gè)樣本設(shè)置3次目的基因的重復(fù)擴(kuò)增。

表1 RT-qPCR引物信息Table 1 Primers for RT-qPCR

1.6 數(shù)據(jù)分析

目的基因的RT-qPCR表達(dá)水平按照內(nèi)參基因的2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，即ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因(Livak and Schmittgen, 2001)，各基因的相對(duì)表達(dá)量經(jīng)log2(X)轉(zhuǎn)換后與高通量測(cè)序中的表達(dá)水平進(jìn)行比較。應(yīng)用SPSS V21.0軟件對(duì)每個(gè)基因處理組與對(duì)照組之間平均相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性進(jìn)行非配對(duì)T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果質(zhì)量

通過對(duì)CK, T18和T36測(cè)序，分別得到原始讀段平均為56 759 342, 45 977 301和54 196 127，過濾后得到高質(zhì)量有效讀段平均分別為55 578 624, 45 032 615和53 121 097。統(tǒng)計(jì)兩端的Q20和Q30分別平均在98.20%和94.85%以上。表明本研究測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可用于進(jìn)一步分析。

2.2 差異表達(dá)基因趨勢(shì)

通過差異表達(dá)基因(DEGs)分析，T18vsCK有1 394個(gè)DEGs，T36vsCK有2 722個(gè)DEGs，說明隨著低溫處理的時(shí)間增長，受影響的基因數(shù)明顯增加。其中兩比較組共有DEGs 1 062個(gè)，T18vsCK特有DEGs有332個(gè)，T36vsCK特有DEGs有1 660個(gè)，上調(diào)趨勢(shì)的DEGs顯著多于下調(diào)趨勢(shì)的DEGs。

對(duì)兩比較組共有的1 062個(gè)DEGs進(jìn)行趨勢(shì)分析，在8個(gè)基因表達(dá)模式中有3個(gè)為顯著基因表達(dá)模式(P<0.05)，包括2個(gè)上調(diào)表達(dá)模式，Profile 6模式為基因表達(dá)量先增加后保持不變，有539個(gè)基因；Profile 7模式為基因表達(dá)量隨低溫脅迫時(shí)間延長一直上調(diào)，有271個(gè)基因；1個(gè)下調(diào)表達(dá)模式Profile 1，為隨低溫脅迫時(shí)間延長基因表達(dá)量先下調(diào)表達(dá)，之后保持不變，有183個(gè)基因(圖1)。多數(shù)基因歸入上述3個(gè)顯著基因表達(dá)模式。

圖1 低溫脅迫不同時(shí)間3日齡意大利蜜蜂封蓋子差異表達(dá)基因表達(dá)趨勢(shì)Fig. 1 Trend analysis of differentially expressed genes (DEGs) in the 3 d-old post-capped brood of Apis mellifera ligustica subjected to low temperature stress for different timeA: DEGs的趨勢(shì)分析結(jié)果，趨勢(shì)類型方框內(nèi)數(shù)字為P值The result of trend analysis of DEGs, the number in the box denoting the P-value; B: Profile 6包含DEGs的表達(dá)模式Expression profile of DEGs in Profile 6; C: Profile 7包含DEGs的表達(dá)模式Expression profile of DEGs in Profile 7; D: Profile 1包含DEGs的表達(dá)模式Expression profile of DEGs in Profile 1. CK: 對(duì)照組(未經(jīng)低溫脅迫的3日齡封蓋子)Control group (3 d-old post-capped brood unexposed to low temperature); T18: 20℃低溫處理18 h的3日齡封蓋子 3 d-old post-capped brood exposed to low temperature (20℃) for 18 h； T36: 20℃低溫處理36 h的3日齡封蓋子 3 d-old post-capped brood exposed to low temperature (20℃) for 36 h. 下圖同The same below.

2.3 差異表達(dá)基因的GO分類

GO富集分析結(jié)果顯示，3日齡意蜂封蓋子在受到低溫脅迫后DEGs歸類到生物學(xué)進(jìn)程的基因數(shù)最多。Profile 6趨勢(shì)上的DEGs分別富集在30個(gè)GO條目上，Profile 7趨勢(shì)上的DEGs富集在28個(gè)GO條目上。這兩種趨勢(shì)從生物學(xué)進(jìn)程分析，主要富集在細(xì)胞進(jìn)程、代謝進(jìn)程、單有機(jī)體進(jìn)程；從分子功能分析，主要富集在結(jié)合、催化活性、分子傳感器活性；從細(xì)胞組件分析，主要富集在細(xì)胞膜組分、細(xì)胞膜、細(xì)胞。除此之外Profile 6趨勢(shì)中的DEGs還富集在核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、生物學(xué)進(jìn)程負(fù)調(diào)控、發(fā)育進(jìn)程、突觸和突觸組分上，而Profile 7趨勢(shì)中還富集在行為(1個(gè))、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合(1個(gè))、細(xì)胞連接等條目上(圖2)。

Profile 1為隨低溫脅迫時(shí)間延長基因表達(dá)量先下調(diào)表達(dá)，之后保持不變，該趨勢(shì)上富集183個(gè)DEGs，這些基因富集在25個(gè)GO條目上，排在前10的GO條目分別為代謝進(jìn)程(28個(gè))、單有機(jī)體進(jìn)程(26個(gè))、結(jié)合(22個(gè))、細(xì)胞進(jìn)程(21個(gè))、催化活性(18個(gè))、細(xì)胞膜組分(12個(gè))、細(xì)胞膜(12個(gè))、細(xì)胞(12個(gè))、細(xì)胞組分(12個(gè))、應(yīng)激(8個(gè))條目上(圖2)。說明低溫脅迫主要影響3日齡封蓋子的代謝進(jìn)程和細(xì)胞結(jié)構(gòu)等。同時(shí)機(jī)體核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、發(fā)育相關(guān)的基因不會(huì)隨著低溫脅迫時(shí)間延長表達(dá)量改變，與行為相關(guān)的基因表達(dá)量隨著低溫脅迫時(shí)間延長而升高。

圖2 低溫脅迫不同時(shí)間3日齡意大利蜜蜂封蓋子差異表達(dá)基因GO富集分析Fig. 2 GO enrichment analysis of differentially expressed genes in the 3 d-old post-capped brood of Apis mellifera ligustica subjected to low temperature stress for different time

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG pathway富集分析

通過KEGG pathway富集分析結(jié)果顯示，Profile 6趨勢(shì)上的DEGs富集在70條信號(hào)通路上，其中有48條與代謝相關(guān)的信號(hào)通路?；驍?shù)富集最多的為代謝途徑(22個(gè))、神經(jīng)活性受體(11個(gè))、次生代謝物的生物合成(11個(gè))、不同環(huán)境中的微生物代謝(8個(gè))、抗生素的生物合成(6個(gè))、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用(5個(gè))、氨基酸的生物合成(5個(gè))、拼接體(5個(gè))、胞吞作用(5個(gè))等；找到基因ILP(insulin-like peptide receptor gene, ID411297)和基因FoxO(forkhead box protein O gene, ID 727091)同時(shí)富集在FoxO信號(hào)通路和壽命調(diào)節(jié)信號(hào)通路上(表2)。

表2 Profile 6中DEGs基因數(shù)富集前12的KEGG通路Table 2 Top 12 KEGG pathways enriched by DEGs of Profile 6

Profile 7趨勢(shì)中的271個(gè)DEGs富集在51條信號(hào)通路上，其中與代謝相關(guān)的信號(hào)通路有31條?；驍?shù)富集最多的為代謝進(jìn)程(16個(gè))、次生代謝物的生物合成(7個(gè))、嘌呤代謝(4個(gè))、賴氨酸降解(3個(gè))、Jak-STAT信號(hào)通路(2個(gè))、Notch信號(hào)通路(2個(gè))、淀粉和蔗糖代謝(2個(gè))、TGF-β信號(hào)通路(2個(gè))、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子(2個(gè))、Hippo信號(hào)通路(2個(gè))；其中基因CBP(CREB-binding protein gene, ID726332)同時(shí)富集在Jak-STAT, Notch, TGF-β, FoxO和Wnt 5條信號(hào)通路上(表3)。

表3 Profile 7中DEGs基因數(shù)富集前12的KEGG通路Table 3 Top 12 KEGG pathways enriched by DEGs in Profile 7

Profile 1模式中183個(gè)DEGs富集在43條信號(hào)通路上。DEGs主要富集在代謝進(jìn)程模塊中，包括新陳代謝總覽中的代謝途徑(13個(gè))、不同環(huán)境中微生物代謝(3個(gè))、次生代謝物的生物合成(3個(gè))；核苷酸代謝中有嘌呤代謝(3個(gè))和嘧啶代謝(3個(gè))；氨基酸代謝中有酪氨酸代謝(2個(gè))、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(2個(gè))；有1個(gè)基因CYP450306a1 (phm, cytochrome P450 306a1 gene, ID08398)富集在昆蟲激素的生物合成信號(hào)通路上，還發(fā)現(xiàn)基因WNT1(protein Wnt-1 gene, ID為413502)同時(shí)富集在Hippo, Wnt和hedgehog(Hh)3條信號(hào)通路上(表4)。

表4 Profile 1中DEGs基因數(shù)富集前13的KEGG通路Table 4 Top 13 KEGG pathways enriched by DEGs in Profile 1

2.5 差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證

利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)隨機(jī)挑選的5個(gè)DEGs (kibra,FoxO,CBP,Myo20和arm)的表達(dá)模式。結(jié)果顯示這些DEGs的表達(dá)水平與RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)的基因表達(dá)水平變化趨勢(shì)一致(圖3)，說明本次轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

圖3 低溫脅迫不同時(shí)間3日齡意大利蜜蜂封蓋子差異表達(dá)基因RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)的RT-qPCR驗(yàn)證Fig. 3 Verification of RNA-Seq sequencing data of differentially expressed genes in the 3 d-old post-capped brood of Apis mellifera ligustica subjected to low temperature stress for different time by RT-qPCRA: T18 vs CK; B: T36 vs CK. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，柱上雙星號(hào)代表同一基因處理組與對(duì)照組之間相對(duì)表達(dá)量差異極顯著(P≤0.01, 非配對(duì)T檢驗(yàn))。Data in theFigure are mean±SD, and the double asterisk above bars represents extremely significant difference between the treatment group and the control group of the same gene in the relative expression level (P≤0.01, unpaired T-test).

3 討論

真社會(huì)性昆蟲蜜蜂蜂子具有典型的狹溫性發(fā)育特點(diǎn)，蜂群維持穩(wěn)定的合適巢溫對(duì)蜂子的健康發(fā)育具有十分重要意義。3日齡封蓋子是蜜蜂進(jìn)行化蛹起始階段(預(yù)蛹期)，其低溫敏感性強(qiáng)。本研究采用趨勢(shì)分析對(duì)兩個(gè)梯度時(shí)間的低溫脅迫預(yù)蛹轉(zhuǎn)錄本表達(dá)模式進(jìn)行聚類分析，得到了梯度低溫脅迫條件下的DEGs及歸類，篩選出具有生物學(xué)意義的基因集和蜜蜂響應(yīng)低溫脅迫的關(guān)鍵基因。在此基礎(chǔ)上，我們重點(diǎn)討論了FoxO信號(hào)通路中的FoxO上調(diào)表達(dá)在低溫脅迫后蜜蜂預(yù)蛹無法蛻皮化蛹中的可能機(jī)制。

低溫脅迫可能導(dǎo)致蛻皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)的合成減少。20E是甾醇類化合物，是在昆蟲前胸腺(prothoracic glands, PG)中以膽固醇或植物固醇類物質(zhì)為底物，經(jīng)一系列酶，特別是碳22-羥化酶、碳2-羥化酶、碳25-羥化酶的催化作用合成的(Gilbertetetal., 2003; Gilbertet, 2004)。在對(duì)下調(diào)模式Profile 1中的DEGs進(jìn)行KEGG富集分析顯示，在激素合成信號(hào)通路上存在一個(gè)下調(diào)基因CYP450306a1 (phm)，它通過調(diào)節(jié)碳25-羥化酶的活性來參與20E合成，phm表達(dá)量下調(diào)將會(huì)導(dǎo)致碳25-羥化酶活性降低，進(jìn)而影響合成20E(Niwaetal., 2004; Warrenetal., 2004)。因此推測(cè)低溫會(huì)影響20E合成，導(dǎo)致其滴度降低。

低溫脅迫后，3日齡封蓋子無法化蛹，可能是由于ILP調(diào)控FoxO磷酸化留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，無法行使其功能而導(dǎo)致無法蛻皮。昆蟲化蛹時(shí)ILP調(diào)控FoxO完成蛻皮的過程如下：在昆蟲中存在脊椎動(dòng)物的胰島素類似物ILP，它的重要靶標(biāo)蛋白為FoxO，在ILP上調(diào)時(shí)，F(xiàn)oxO發(fā)生磷酸化，無法進(jìn)入細(xì)胞核而留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞生長，延遲化蛹(Panetal., 2018)；當(dāng)ILP下調(diào)時(shí)，F(xiàn)oxO去磷酸化入核與20E和EcR-Usp聚合體激活后，誘導(dǎo)Br-C,E75A和E75B等初級(jí)及DHR3,DHR4和ftz-f1等次級(jí)應(yīng)答基因表達(dá)，來激活羧肽酶-A(CPA)表達(dá)完成蛻皮發(fā)生(Gonzyetal., 2002; Zhou and Riddiford, 2002; Wu and Brown, 2006; Minakuchietal., 2008; Jinderetal., 2013)。在研究中上調(diào)模式Profile 6的差異表達(dá)基因的富集分析結(jié)果顯示，在蛻皮相關(guān)的FoxO信號(hào)通路(3個(gè))、與壽命相關(guān)的壽命調(diào)節(jié)信號(hào)通路(2個(gè))同時(shí)富集到了ILP和FoxO基因。ILP的表達(dá)量上調(diào)會(huì)導(dǎo)致FoxO磷酸化后無法入核留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，無法被20E和EcR-Usp聚合體激活，導(dǎo)致20E的初級(jí)應(yīng)答基因Br-C無法接受20E信號(hào)，蛻皮信號(hào)傳遞受阻。另外，20E具有拮抗胰島素的類似物ILP的作用，同時(shí)與ILP共同調(diào)控FoxO信號(hào)通路，從前一段論述低溫脅迫可能導(dǎo)致20E滴度降低，也正好與該結(jié)果相符。因此推測(cè)在3日齡封蓋子在受到低溫脅迫后，F(xiàn)oxO發(fā)生磷酸化留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不能入核，是阻礙蜜蜂化蛹的一個(gè)關(guān)鍵基因?；际且粋€(gè)極其復(fù)雜的過程，蛻皮只是其中的一個(gè)環(huán)節(jié)，除了蛻皮受到影響之外，低溫脅迫帶來的影響應(yīng)該還有很多，仍然需要繼續(xù)關(guān)注。

我們前期研究結(jié)果顯示3日齡意蜂封蓋子在受到低溫脅迫后壽命顯著縮短(Wangetal., 2016)，F(xiàn)oxO在果蠅的壽命調(diào)節(jié)起到重要作用(Tataretal., 2004)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示FoxO基因在受到低溫脅迫時(shí)表達(dá)量發(fā)生改變，這也可能是受到低溫脅迫后，蜜蜂壽命縮短的原因之一。

致謝福建農(nóng)林大學(xué)科研助手劉也齊參與樣本獲取工作，碩士研究生劉一名、馮睿蓉和李寒參與部分文獻(xiàn)研究工作，本科生馮海成、蔣心怡、赫昱暢、常斐然參與部分實(shí)驗(yàn)，在此表示感謝！