田彩紅, 劉曉光, 黃建榮, 王 瑛, 封洪強(qiáng)，*

(1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 河南省農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)部華北南部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南省作物保護(hù)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 河南省生物農(nóng)藥工程研究中心, 鄭州 450002; 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 省部共建小麥玉米作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 鄭州 450002)

二點(diǎn)委夜蛾Athetislepigone屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)委夜蛾屬Athetis(Bomare, 2002)，是一種在世界范圍內(nèi)分布的以30多種寄主植物為食的多食性害蟲(chóng)(Lindeborg, 2007)。該害蟲(chóng)的幼蟲(chóng)2005年首次在河北被發(fā)現(xiàn)危害夏玉米苗，2011年在黃淮海地區(qū)暴發(fā)成災(zāi)(王振營(yíng)等, 2012; Lietal., 2013)。隨著我國(guó)農(nóng)作物免耕播種、秸稈還田、種肥同播的普遍采用，加之簡(jiǎn)單的小麥-玉米連作制度的影響，其發(fā)生范圍逐漸擴(kuò)大，于2017年在河北唐山地區(qū)再次暴發(fā)(張尚卿等, 2018)。目前，二點(diǎn)委夜蛾已經(jīng)成為我國(guó)黃淮海地區(qū)夏玉米上的常發(fā)性苗期害蟲(chóng)，是黃淮海夏玉米區(qū)的重點(diǎn)防控對(duì)象(王振營(yíng)和王曉鳴, 2019)。其成蟲(chóng)善遷飛(Fuetal., 2014; 黃建榮等, 2018)，幼蟲(chóng)喜陰暗潮濕環(huán)境，畏強(qiáng)光，常躲在玉米幼苗周?chē)乃辂溄障挛：Γ？惺趁缙谟衩赘?，造成玉米植株損傷，缺苗斷垅。在夏玉米產(chǎn)區(qū)暴發(fā)，常常呈現(xiàn)發(fā)生面積大、蟲(chóng)口密度高和危害程度重的特點(diǎn)，并造成大片死苗，嚴(yán)重威脅夏玉米安全生產(chǎn)(江幸福等, 2011; 石潔等, 2011)。由于該蟲(chóng)的隱蔽危害習(xí)性，單次化學(xué)防治效果甚微，常造成多次施藥，不僅增加了該蟲(chóng)抗性產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)，且污染了生態(tài)環(huán)境。因此，準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)和誘殺二點(diǎn)委夜蛾成為目前亟待解決的難題，迫切需要有一種高效、持久、穩(wěn)定、環(huán)境友好、不傷害天敵和保護(hù)生態(tài)平衡的玉米害蟲(chóng)綜合防治技術(shù)體系，也是“農(nóng)藥化肥雙減”和“農(nóng)藥零增長(zhǎng)”的迫切要求(吳孔明, 2018; 張凱等, 2019)。

昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期進(jìn)化中，通過(guò)自身嗅覺(jué)機(jī)體反應(yīng)，可以感知環(huán)境中的揮發(fā)性物質(zhì)，并依此信息覓食、求偶和尋找適宜的產(chǎn)卵場(chǎng)所。觸角感器中的嗅覺(jué)受體與脂溶性氣味物質(zhì)特異性識(shí)別與反應(yīng)，是昆蟲(chóng)識(shí)別外界氣味物質(zhì)的重要一環(huán)，使昆蟲(chóng)可以特異地識(shí)別環(huán)境中無(wú)數(shù)不同的化學(xué)物質(zhì)(Bargmannetal., 2006; Pelosietal., 2018)，也為開(kāi)發(fā)新型害蟲(chóng)防控技術(shù)提供了重要理論基礎(chǔ)。昆蟲(chóng)的非典型嗅覺(jué)受體(olfactory receptor co-receptor, Orco)能與傳統(tǒng)嗅覺(jué)受體形成復(fù)合體，共同形成異源二聚體配體門(mén)控陽(yáng)離子通道，促進(jìn)傳統(tǒng)嗅覺(jué)受體在神經(jīng)元樹(shù)突上的定位并維持其穩(wěn)定性，提高傳統(tǒng)嗅覺(jué)受體對(duì)氣味反應(yīng)的效率(Satoetal., 2008; Wicheretal., 2008; Kaupp, 2010; Changetal., 2017; Butterwicketal., 2018)。昆蟲(chóng)的非典型嗅覺(jué)受體的氨基酸序列在不同昆蟲(chóng)間高度保守，其編碼基因已在8個(gè)目的40多種昆蟲(chóng)中得以鑒定(Stengl and Funk, 2013)，諸如：鱗翅目的家蠶Bombyxmori、煙芽夜蛾Heliothisvirescens、雙委夜蛾Athetisdissimilis等(Nakagawaetal., 2005; 宋月芹等, 2015; Liuetal., 2017)，同翅目的麥長(zhǎng)管蚜Sitobionavenae(Fanetal., 2015)，半翅目的綠盲蝽Apolyguslucorum(Zhouetal., 2014)和鞘翅目的廣聚螢葉甲Ophraellacommuna(Maetal., 2019)。Orco的組織特異性表達(dá)也在直翅目的東亞飛蝗Locustamigratoria和沙漠蝗Schistocercagregaria(Yangetal., 2012)，鱗翅目的斜紋夜蛾Spodopteralitura(Wuetal., 2013)和桃蛀螟Conogethespunctiferalis(葛星等, 2013)，以及膜翅目的棉鈴蟲(chóng)齒唇姬蜂Campoletischlorideae(董鈞鋒等, 2015)中得到了詳細(xì)的闡明。

二點(diǎn)委夜蛾作為我國(guó)耕作制度變革和氣候變化引發(fā)的新害蟲(chóng)，其化學(xué)通訊行為值得深入研究。Zhang等(2017, 2019)利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析鑒定了二點(diǎn)委夜蛾的28個(gè)觸角氣味蛋白和20個(gè)化學(xué)感受蛋白的生物信息學(xué)功能，并利用雙電極電壓鉗技術(shù)研究了二點(diǎn)委夜蛾的4個(gè)信息素受體基因的功能。但對(duì)二點(diǎn)委夜蛾的非典型嗅覺(jué)受體基因AlepOrco的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，研究昆蟲(chóng)間高度保守的二點(diǎn)委夜蛾Orco基因，解析其在氣味分子識(shí)別過(guò)程中的機(jī)制，探索通過(guò)調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)的行為來(lái)防治二點(diǎn)委夜蛾的新技術(shù)，具有一定的理論價(jià)值。本研究在二點(diǎn)委夜蛾雌雄觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，結(jié)合RT-PCR技術(shù)，克隆并鑒定了二點(diǎn)委夜蛾非典型嗅覺(jué)受體基因，并在大腸桿菌Escherichiacoli中進(jìn)行了原核表達(dá)，制備并檢測(cè)了該基因的多克隆抗體，同時(shí)利用qPCR技術(shù)檢測(cè)了該基因在雌雄成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)，以期為解析該基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

二點(diǎn)委夜蛾為本實(shí)驗(yàn)室在溫度為26±1℃，相對(duì)濕度為85%，光周期為15L∶9D的條件下用人工飼料飼養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)種群(田彩紅等, 2013)。雌雄蛹分開(kāi)放置在不同養(yǎng)蟲(chóng)籠中等待羽化，成蟲(chóng)羽化后飼喂以10%的蜂蜜水補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，備用。

1.2 樣品的收集及總RNA的提取

取羽化3 d的未交配的二點(diǎn)委夜蛾雌雄成蟲(chóng)各100頭，取其觸角、頭部(去除觸角和喙)、喙、胸、腹、足和翅。每50～100 mg上述組織放入含有1 mL Trizol(Invitrogen公司)的離心管中，加適量液氮迅速充分研磨，提取得到總RNA?？俁NA經(jīng)DNaseⅠ酶(TaKaRa公司)消化后，用NanoDropTM檢測(cè)并記錄其濃度，保證OD260/OD280比值在1.8～2.0之間。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 的完整性。

1.3 二點(diǎn)委夜蛾Orco基因的克隆鑒定

以本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的二點(diǎn)委夜蛾雌、雄成蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組unigene序列(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，建立核苷酸本地BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)姚雪等(2019)調(diào)取同源基因的方法，以家蠶非典型嗅覺(jué)受體基因氨基酸序列(GenBank登錄號(hào): NP_001037060.1)為誘餌蛋白，通過(guò)tBlastn搜索，釣取二點(diǎn)委夜蛾候選蛋白，獲得二點(diǎn)委夜蛾OrcomRNA全長(zhǎng)。 將獲得的OrcomRNA序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)二點(diǎn)委夜蛾Orco(AlepOrco)特異性引物AlepOrco-F和AlepOrco-R(表1，酶切位點(diǎn)以下劃線標(biāo)示)。將1.2節(jié)提取的總RNA 2 μg按照SMART cDNA Library Construction Kit(Clontech公司)合成方法合成cDNA第1鏈。RT-PCR反應(yīng)體系(25 μL): cDNA模板2 μL, Premix Taq Version 2.0試劑12.5 μL, AlepOrco-F/AlepOrco-R引物各1 μL，去離子水8.5 μL。反應(yīng)條件： 94℃預(yù)變性3 min; 95℃ 30 s, 56℃ 1 min, 72℃ 1 min, 33個(gè)循環(huán)； 72℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并用DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)回收目的片段。將回收的PCR產(chǎn)物按照3∶1的摩爾濃度連接到pMD18-T載體(TaKaRa公司)(重組質(zhì)粒命名為pMD18-T/AlepOrco)，轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選挑出陽(yáng)性克隆，將獲得的陽(yáng)性克隆分別大量培養(yǎng)，利用質(zhì)粒小量制備試劑盒提取質(zhì)粒DNA(Axygen公司)，利用BamHⅠ和XhoⅠ(TaKaRa)雙酶切鑒定重組克隆pMD18-T/AlepOrco，將對(duì)應(yīng)的正確克隆在生工生物工程上海股份有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 生物信息學(xué)分析

將1.3節(jié)中測(cè)序正確的二點(diǎn)委夜蛾Orco核苷酸序列進(jìn)行氨基酸序列預(yù)測(cè)，然后利用在線軟件Expasy (https:∥www.expasy.org/) 進(jìn)行蛋白質(zhì)性質(zhì)分析；氨基酸序列理化性質(zhì)分析參考Gasteiger等(2005)分析方法。采用在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，同時(shí)利用在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜域預(yù)測(cè)。搜集其他已知昆蟲(chóng)Orco氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，比對(duì)結(jié)果用GeneDoc 2.7軟件進(jìn)行編輯(https:∥genedoc.software.informer.com/)。此外，根據(jù)搜集到的Orco基因的氨基酸序列，在在線軟件(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)中，選擇Jones-Taylor-Thornton (JTT)模型，利用最大似然法(maximum likelihood method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.5 二點(diǎn)委夜蛾Orco原核表達(dá)及Western blot檢測(cè)

將pMD18-T/AlepOrco經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，與經(jīng)同樣酶切的原核表達(dá)載體pGEX-6P-1(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)安世恒教授惠贈(zèng))連接，目的片段和酶切的質(zhì)粒載體比例為3∶1。在T4 DNA連接酶(TaKaRa)的作用下16℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒(命名為pGEX/AlepOrco)質(zhì)粒DNA，BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的陽(yáng)性克隆送生工生物工程上海股份有限公司測(cè)序。

將上述經(jīng)鑒定正確的pGEX/AlepOrco質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)安世恒教授惠贈(zèng))感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落置于5mL LB培養(yǎng)基(含AMP 100 μg/mL)中，200 r/min于37℃下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按0.1%(體積比)活化轉(zhuǎn)接5 mL LB培養(yǎng)基(含AMP 100 μg/mL)，200 r/min于37℃振蕩培養(yǎng)至OD值達(dá)0.6～0.8時(shí)，加IPTG(生工生物工程上海股份有限公司)分別至終濃度為10, 20和40 mmol/L，37℃ 150 r/min 誘導(dǎo)8 h。6 000 r/min離心5 min收集菌體沉淀。用200 μL的1×PBS將沉淀重新懸浮，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，加入200 μL的SDS凝膠上樣緩沖液[含40 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)，10%甘油，2% SDS，5%巰基乙醇，0.1%溴酚藍(lán)]后用漩渦混勻器震蕩懸浮，沸水中煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min離心后取上清，置4℃保存?zhèn)溆?程曉東等, 2011)。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳參照徐秋芳等(2014)方法進(jìn)行，Western blot 分析參照Sambrook等(1998)的方法進(jìn)行。具體為：蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，取與分離膠相同大小的PVDF膜(Millipore)，在冰浴條件下用濕式轉(zhuǎn)膜儀以120 V電壓，轉(zhuǎn)膜1.5 h, 然后用含有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗GST標(biāo)簽鼠單克隆抗體(BBI)的一抗封閉液(含2‰ Tween-20的1×PBS)，4℃冰箱中封閉過(guò)夜；第2天，室溫反應(yīng)30 min，用洗滌緩沖液(含0.5% Tween-20的pH 7.4 的0.02 mol/L PBS)洗膜3次；加入封閉液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗(Promega)，室溫反應(yīng)2 h，用洗滌緩沖液洗膜3次；最后將膜置于含有DAB(Promega)的顯色液(0.1 mol/L PBS 10 mL；臨用前加DAB 4 mg, 10% H2O260 μL)中顯色至條帶清晰，將膜置于雙蒸水中終止顯色反應(yīng)并拍照。

1.6 抗體的制備及特異性檢測(cè)

表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，割膠回收并純化表達(dá)的蛋白。多克隆抗體的制備參照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(程曉東等, 2011)進(jìn)行，免疫新西蘭大白兔的工作由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司協(xié)助完成，取其免疫前血清作為陰性對(duì)照?？贵w特異性檢測(cè)參照Tian等(2009)進(jìn)行，具體操作為：取二點(diǎn)委夜蛾羽化后3 d內(nèi)的未交配雌雄成蟲(chóng)觸角各300對(duì)，加入適量的緩沖液(1×PBS)，在冰浴條件下利用電動(dòng)組織研磨器研磨勻漿，加入等體積的蛋白上樣緩沖液[含100 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)，200 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)，4% SDS，0.2%溴酚藍(lán)，20%甘油]，沸水煮10 min，4℃條件下12 000 r/min離心10 min，取上清10 μL，進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，Western blot的一抗采用制備的多克隆抗體，二抗采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(Promega)，陰性對(duì)照采用免疫前血清。

1.7 AlepOrco在二點(diǎn)委夜蛾成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)

將1.3節(jié)獲得二點(diǎn)委夜蛾非典型嗅覺(jué)受體基因序列用Primer3web Version 4.1.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性引物(Untergasseretal., 2012; K?ressaaretal., 2018)。AlepOrco-RT-F和AlepOrco-RT-R(表1)用于測(cè)定AlepOrco在二點(diǎn)委夜蛾成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)，以AlepGAPDH作為內(nèi)參基因(Zhangetal., 2017)，引物序列見(jiàn)表1。引物由生工生物工程上海股份有限公司負(fù)責(zé)合成。具體操作方法如下：取2 μg 1.2節(jié)獲得的各組織總RNA，DNaseⅠ酶消化后，按照試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。之后，按照SYBRPremixExTaqTM(Tli RNaseH Plus) (TaKaRa)的使用說(shuō)明配制PCR反應(yīng)液，反應(yīng)體系(20 μL): SYBRPremixExTaqTMII 10 μL, 上下游引物(0.2 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, 經(jīng)DEPC(TaKaRa)處理的滅菌超純水7 μL。每個(gè)樣本組織設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)的組織樣本分別來(lái)自羽化3 d未交配的二點(diǎn)委夜蛾雌、雄成蟲(chóng)各100頭，每樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)。在StepOnePlusTMReal-Time PCR System (Applied Biosystems, USA)定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性10 s, 60℃退火30 s, 共計(jì)40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析后提取有效樣品數(shù)據(jù)，陰性對(duì)照為在反應(yīng)體系中加入不含DNA模板的DEPC處理過(guò)的滅活雙蒸水。

1.8 數(shù)據(jù)分析

以二點(diǎn)委夜蛾雌蛾觸角中Orco基因的表達(dá)量為基準(zhǔn)(宋月芹等, 2015)，利用2-ΔΔCt方法(Livak and Schmittgen, 2001)計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，采用3次生物學(xué)實(shí)驗(yàn)重復(fù)，誤差取3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件；相同組織不同性別間基因表達(dá)量差異用t測(cè)驗(yàn)，相同性別不同組織間基因表達(dá)量差異用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 二點(diǎn)委夜蛾Orco基因的克隆及序列分析

獲得了二點(diǎn)委夜蛾AlepOrco基因(GenBank登錄號(hào): MN583125)cDNA全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度為1 422 bp，共編碼473個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為8.59，分子量為53.40 kD。

序列分析表明該基因編碼蛋白AlepOrco氨基酸序列中不存在信號(hào)肽序列，但存在7個(gè)跨膜區(qū)，分別位于第45-65, 74-97, 135-158, 193-216, 333-356, 375-396和446-469位氨基酸處。疏水性分析表明，親脂性氨基酸占據(jù)了序列的大部分，尤其是第800-1 000位氨基酸的親脂性較高，在第0-200位氨基酸后也存在較高親脂性區(qū)域。在編碼的473個(gè)氨基酸中，疏水氨基酸個(gè)數(shù)和對(duì)應(yīng)的占編碼的氨基酸總百分?jǐn)?shù)分別是：51個(gè)亮氨酸(Leu)，占10.8%；41個(gè)丙氨酸(Ala)，占8.7%；36個(gè)絲氨酸(Ser)，占7.6%；36個(gè)蘇氨酸(Thr)，占7.6%；31個(gè)苯丙氨酸(Phe)，占6.6%；31個(gè)纈氨酸(Val)，占6.6%。蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為30.67，脂溶指數(shù)為93.64，總親水性平均系數(shù)為0.23，可推測(cè)該蛋白為脂溶性蛋白。

氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果表明，二點(diǎn)委夜蛾Orco與其他鱗翅目昆蟲(chóng)Orco氨基酸序列一致性在90%以上，其中與雙委夜蛾Orco的氨基酸序列一致性最高，達(dá)99.15%；與鱗翅目其他昆蟲(chóng)如疆夜蛾P(guān)eridromasaucia、粘蟲(chóng)Mythimnaseparata、草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda、煙青蟲(chóng)Helicoverpaassulta、黃地老虎Agrotissegetum和大螟Sesamiainferens等的Orco的氨基酸序列一致性分別為96.83%, 96.41%, 95.77%, 95.56%, 95.35%和95.14%；與其他目昆蟲(chóng)Orco氨基酸序列一致性較與鱗翅目的稍低，其中與黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的Orco氨基酸序列一致性為75.30%(圖1)。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，二點(diǎn)委夜蛾Orco與同屬夜蛾科的雙委夜蛾的Orco親緣關(guān)系最近，其次是與粘蟲(chóng)、疆夜蛾和黃地老虎的Orco，而與同屬鱗翅目蠶蛾科的家蠶、菜蛾科的小菜蛾P(guān)lutellaxylostella和螟蛾科的二化螟Chilosuppressalis的Orco親緣關(guān)系稍遠(yuǎn),與雙翅目的黑腹果蠅的Orco親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖2)，這與Orco氨基酸序列同源聯(lián)配分析結(jié)果(圖1)是相吻合的。

圖1 二點(diǎn)委夜蛾與其他昆蟲(chóng)Orco的氨基酸序列比對(duì)Fig. 1 Amino acid sequence alignment of Orco proteins from Athetis lepigone and other insects 不同昆蟲(chóng)種的Orco及其GenBank登錄號(hào)Orco proteins from different insect species and their respective GenBank accession numbers: Alep: 二點(diǎn)委夜蛾Athetis lepigone (AOE41007.1); Adis: 雙委夜蛾Athetis dissimilis (KR632987); Psau: 疆夜蛾P(guān)eridroma saucia (AQY16413.1); Msep: 粘蟲(chóng)Mythimna separata (BAG71415.1); Hass: 煙青蟲(chóng)Helicoverpa assulta (ABU45983.2); Harm: 棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera (XP_021195606.1); Sinf: 大螟Sesamia inferens (AGY14565.1); Aseg: 黃地老虎Agrotis segetum (AGS41440.1); Hvir: 苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca (AFI25169.1); Slit: 斜紋夜蛾Spodoptera littoralis (ABQ82137.1); Hzea: 谷實(shí)夜蛾Helicoverpa zea (AAX14773.1); Sexi: 甜菜夜蛾Spodoptera exigua (AAW52583.1); Pxyl: 小菜蛾P(guān)lutella xylostella (XP_011558816.1); Csup: 二化螟Chilo suppressalis (AFQ94041.1); Bmor: 家蠶Bombyx mori (NP_001037060.1); Dmel: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster (NP_524235.2). 圖2同The same forFig. 2. 黑色陰影表示氨基酸序列100%一致性，灰色陰影表示序列80%一致性。The amino acid sequences with 100% identity are in black shade, while those with 80% identity are in grey shade.

圖2 最大似然法構(gòu)建的基于氨基酸序列的昆蟲(chóng)Orco 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(MEGA ver. 7.0.14, 1 000次重復(fù))Fig. 2 Phylogenic tree of Orco proteins from different insect species based on amino acid sequences by maximum likelihood method (MEGA ver. 7.0.14, 1 000 replicates) 遺傳距離以比例標(biāo)尺表示。Genetic distance is indicated by scale bar.

2.2 二點(diǎn)委夜蛾Orco原核表達(dá)與Western blot分析

經(jīng)終濃度為10 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，蛋白表達(dá)量最大(圖3: A，泳道3)，產(chǎn)生79 kD左右的特異性蛋白條帶(圖3: A, 泳道3, 4, 5)，而未插入目的片段的pGEX-6P-1空載體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生26 kD大小的蛋白條帶(圖3: A, 泳道2)。以鼠抗GST標(biāo)簽單克隆抗體為一抗對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析，pGEX/AlepOrco經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生約79 kD的蛋白條帶與GST抗體發(fā)生了很強(qiáng)的交叉反應(yīng)(圖3: B, 條帶以箭頭標(biāo)記)，表明融合蛋白得到了有效表達(dá)。

圖3 pGEX/AlepOrco的原核表達(dá)蛋白的SDS-PAGE (A) 和Western blot (B)分析Fig. 3 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analysis of the expressed protein of pGEX/AlepOrco in prokaryotic expression system M: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker; 1: BL21陰性對(duì)照BL21 negative control; 2: pGEX-6P-1轉(zhuǎn)化BL21的表達(dá)產(chǎn)物Expression product of pGEX-6P-1 in BL21; 3: IPTG終濃度為10 mmol/L時(shí)，pGEX/AlepOrco的表達(dá)產(chǎn)物Expression product of pGEX/AlepOrco induced by IPTG (10 mmol/L); 4: IPTG終濃度為20 mmol/L 時(shí)，pGEX/AlepOrco的表達(dá)產(chǎn)物Expression product of pGEX/AlepOrco induced by IPTG (20 mmol/L); 5: IPTG終濃度為40 mmol/L時(shí)，pGEX/AlepOrco的表達(dá)產(chǎn)物Expression product of pGEX/AlepOrco induced by IPTG (40 mmol/L); 6: IPTG終濃度為10 mmol/L時(shí), pGEX/AlepOrco的表達(dá)產(chǎn)物(箭頭標(biāo)示)Expression product (marked by an arrow) of pGEX/AlepOrco induced by IPTG (10 mmol/L).

2.3 二點(diǎn)委夜蛾Orco多克隆抗體檢測(cè)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在二點(diǎn)委夜蛾的雌雄成蟲(chóng)觸角蛋白中出現(xiàn)了53 kD左右的印跡(圖4: 條帶2和4),而在以免疫前兔血清作為一抗的對(duì)照中，在二點(diǎn)委夜蛾雌雄成蟲(chóng)觸角中并沒(méi)有檢測(cè)到特異性條帶(圖4: 條帶1和3)。表明所制備的多克隆抗體能夠特異的識(shí)別二點(diǎn)委夜蛾成蟲(chóng)觸角內(nèi)的Orco蛋白。

圖4 Western blot檢測(cè)抗體對(duì)二點(diǎn)委夜蛾雌雄成蟲(chóng) 觸角中AlepOrco的特異性Fig. 4 Antibody specificity to AlepOrco protein in antennae of female and male adults of Athetis lepigone by Western blotting 1: 雌成蟲(chóng)觸角(一抗為免疫前兔血清，作為對(duì)照)Antenna of female adults (preimmune serum was used as the primary antibodies for control); 2: 雌成蟲(chóng)觸角(一抗為所制備的多克隆抗體)Antenna of female adults (anti-AlepOrco was used as the primary antibodies); 3: 雄成蟲(chóng)觸角(一抗為免疫前兔血清，作為對(duì)照)Antenna of male adults (pre-immune serum was used as the primary antibodies for control); 4: 雄成蟲(chóng)觸角(一抗為所制備的多克隆抗體)Antenna of male adults (anti-AlepOrco was used as the primary antibodies).

2.4 二點(diǎn)委夜蛾Orco在成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)

qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，AlepOrco在二點(diǎn)委夜蛾雌雄成蟲(chóng)(F=42.75,P<0.01)和不同組織間(F=112.41,P<0.01)存在顯著的差異，AlepOrco在雌雄成蟲(chóng)不同組織中具有相似的表達(dá)模式，都是在觸角中的相對(duì)表達(dá)量最大，在翅中的相對(duì)表達(dá)量最小。在雄成蟲(chóng)不同組織間，AlepOrco表達(dá)量差異顯著(F=88.9,P<0.01)，在雄成蟲(chóng)的觸角中表達(dá)量最高，約是雌成蟲(chóng)觸角中表達(dá)量的5.7倍；其次為在雄成蟲(chóng)的喙部，與其他組織相比，差異顯著(P<0.05)，足部次之，然后依次為腹部、胸部、去除觸角和喙的頭部，在翅中的相對(duì)表達(dá)量最低。AlepOrco在雌成蟲(chóng)不同組織間的表達(dá)量也不同(F=169.6,P<0.01)，盡管與雄成蟲(chóng)具有相似的表達(dá)模式，但是，與在第2位的足部中的表達(dá)量相比，并沒(méi)有達(dá)到顯著差異(P>0.05)，足部的相對(duì)表達(dá)量則顯著大于喙部，其后依次為：在腹部中的相對(duì)表達(dá)量顯著大于胸部中的，胸部中的相對(duì)表達(dá)量顯著大于去除觸角和喙的頭部中的(P<0.05)，去除觸角和喙的頭部中的相對(duì)表達(dá)量顯著大于翅的(P<0.05)(圖5)。

圖5 qPCR分析AlepOrco在二點(diǎn)委夜蛾雌雄成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)譜Fig. 5 Expression profiles of AlepOrco in different tissues of female and male adults of Athetis lepigone detected by qPCR 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上不同大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別代表AlepOrco基因表達(dá)在雄成蟲(chóng)和雌成蟲(chóng)不同組織間的相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性(P<0.01, ANOVA和Duncan氏新復(fù)極差法)；柱上ns、星號(hào)和雙星號(hào)分別表示基因表達(dá)量在相同組織不同性別間差異不顯著(P>0.05)、差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)(t測(cè)驗(yàn))。Data in theFigure are mean±SE. Different capital and lowercase letters above bars indicate significant differences in the gene expression level of male and female adults between different tissues (ANOVA and Duncan’s new multiple range test, P<0.01), respectively. ns, asterisk and double asterisk above bars represent no significant difference (P>0.05), significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively, in the gene expression level in the same tissue among different sexes (t-test).

3 討論

本研究對(duì)二點(diǎn)委夜蛾的非典型嗅覺(jué)受體基因進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)和多克隆抗體制備，并明確了其在雌雄成蟲(chóng)不同組織內(nèi)的分布，為將來(lái)利用RNAi或者基因編輯系統(tǒng)等深入研究其基因功能，明確其嗅覺(jué)分子機(jī)制，闡明其是否具有味覺(jué)功能奠定了基礎(chǔ)。

序列比對(duì)分析表明，二點(diǎn)委夜蛾Orco與雙委夜蛾Orco氨基酸序列的一致性高達(dá)99%，進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果也表明了二者親緣關(guān)系最近(圖1和2)?？赡苁且?yàn)槎咄瑢禀[翅目夜蛾科委夜蛾屬，具有相似的基因起源，研究表明，這兩種昆蟲(chóng)具有相似地理分布及危害方式，常常在夏玉米田混合發(fā)生，都具有隱蔽危害習(xí)性(宋月芹等, 2015)。Orco在昆蟲(chóng)嗅覺(jué)神經(jīng)嗅覺(jué)系統(tǒng)中廣泛表達(dá), 在不同目間高度保守(Kriegeretal., 2003; Bargmann, 2006)。本研究發(fā)現(xiàn)，二點(diǎn)委夜蛾Orco與鱗翅目的疆夜蛾、粘蟲(chóng)、草地貪夜蛾、煙青蟲(chóng)、黃地老虎、大螟等序列高度保守，一致性高達(dá)95%以上，與雙翅目的黑腹果蠅的Orco關(guān)系較遠(yuǎn)，一致性為75%(圖2)。

本研究原核表達(dá)了二點(diǎn)委夜蛾Orco開(kāi)放閱讀框蛋白，并利用回收的蛋白制備了多克隆抗體。經(jīng)IPTG在37℃誘導(dǎo)下，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)結(jié)果證明，基因得到了有效表達(dá)(圖3)。通過(guò)回收蛋白制備抗體過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)所表達(dá)的蛋白主要以包涵體的形式存在于菌體沉淀中。這種不溶性蛋白質(zhì)顆粒形式存在的表達(dá)產(chǎn)物，不具有生物學(xué)活性，今后的工作是嘗試在真核表達(dá)系統(tǒng)(例如桿狀病毒昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))進(jìn)行表達(dá)，以獲得應(yīng)用廣泛的可溶性融合蛋白，并對(duì)AlepOrco基因的分子生物學(xué)功能進(jìn)行深入研究。目前的研究，對(duì)抗體的利用主要在利用抗體組織定位方面，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法在岡比亞按蚊Anophelesgambiae、埃及伊蚊Aedesaegypti和致倦庫(kù)蚊Culexquinquefasciatus的觸角、下顎須和喙中均檢測(cè)到了Orco蛋白，通過(guò)進(jìn)一步在3種蚊子的觸角感受器進(jìn)行定位發(fā)現(xiàn)蛋白主要分布在岡比亞按蚊觸角鞭節(jié)除基部第1節(jié)部分的各節(jié)，不同的是埃及伊蚊和致倦庫(kù)蚊Orco在所有鞭節(jié)上均有分布(Meloetal., 2004; Pittsetal., 2004; Xia and Zwiebel, 2006)，且埃及伊蚊的Orco僅分布在第1鞭節(jié)的末端1/3處(Meloetal., 2004)。中華蜜蜂ApisceranaceranaOrco被定位在觸角鞭節(jié)的板形感器和毛形感器上，且在毛形感器上較多(張林雅等, 2012; 張中印等, 2016)。本研究制備的抗體為在已經(jīng)明確了二點(diǎn)委夜蛾觸角感器種類(lèi)的基礎(chǔ)上(田彩紅等, 2015, 2016)進(jìn)行下一步的組織定位及功能研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究通過(guò)qPCR表明，AlepOrco在二點(diǎn)委夜蛾雄成蟲(chóng)觸角中表達(dá)量最高，是在雌蛾觸角中表達(dá)量的5.7倍(圖5)，該表達(dá)模式與多數(shù)昆蟲(chóng)Orco如雙委夜蛾(宋月芹等, 2015)，華山松大小蠹Dendroctonusarmandi(Zhangetal., 2016)，中華蜜蜂(張中印等, 2016)等昆蟲(chóng)的表達(dá)分布情況一致。AlepOrco除了在觸角中高表達(dá)之外，在去除觸角和喙的成蟲(chóng)的頭部、喙、胸、腹、足和翅中也有表達(dá)(圖5)，不同于同為鱗翅目的斜紋夜蛾，其Orco僅在觸角中特異性表達(dá)(Dongetal., 2012)，而與無(wú)花果黃蜂CeratosolensolmsiOrco(Luetal., 2009)、中華蜜蜂Orco(張林雅等, 2012)、桃蛀螟DichocrocispunctiferalisOrco(葛星等, 2013)和西方角蠅HaematobiairritansOrco(Olafson, 2013)的分布表達(dá)情況一致。尤其是在足部，AlepOrco表達(dá)量位于這7個(gè)組織中表達(dá)量的第2位(圖5)，與雙委夜蛾Orco(宋月芹, 2015)相反，其在雄蟲(chóng)中表達(dá)量略大于雌蟲(chóng)中的，與致倦庫(kù)蚊只在雄蟲(chóng)足中Orco的表達(dá)(Xia and Zwiebel, 2006)又有所不同。本研究發(fā)現(xiàn)，在二點(diǎn)委夜蛾雌雄成蟲(chóng)喙中AlepOrco的表達(dá)量?jī)H次于在觸角和足中的表達(dá)量，且在雄成蟲(chóng)喙部的表達(dá)量大于在雌成蟲(chóng)喙部的表達(dá)量，但無(wú)顯著差異(圖5)，而同為鱗翅目的甜菜夜蛾SpodopteraexiguaOrco在雌雄蛾的觸角和喙中也都有表達(dá)，但喙中表達(dá)量極低(張逸凡等, 2011)。直翅目的飛蝗Locustamigratoria和沙漠蝗Schistocercagregaria的成蟲(chóng)口器中也有Orco的表達(dá)(Yangetal., 2012), 說(shuō)明在味覺(jué)感受器中Orco也有表達(dá)。我們?cè)谟脪呙桦婄R研究二點(diǎn)委夜蛾觸角及附肢的感器類(lèi)型時(shí)，在二點(diǎn)委夜蛾的成蟲(chóng)喙部也觀察了豐富的感器類(lèi)型(田彩紅等, 2015, 2016)，而Krieger等(2002)利用原位雜交的方法在煙芽夜蛾的喙的感受器細(xì)胞中也檢測(cè)到Orco, 進(jìn)而推測(cè)，Orco在發(fā)揮嗅覺(jué)功能的同時(shí)是否行使了味覺(jué)功能，值得將來(lái)進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)克隆和原核表達(dá)二點(diǎn)委夜蛾Orco基因，并制備了蛋白的多克隆抗體，并明確了在雌雄成蟲(chóng)不同組織內(nèi)的分布，為將來(lái)利用RNAi或者基因編輯系統(tǒng)等深入研究其基因功能，明確其嗅覺(jué)分子機(jī)制，闡明其是否具有味覺(jué)功能奠定了基礎(chǔ)。

致謝特別感謝美國(guó)密蘇里大學(xué)崔英俊博士對(duì)本文做出的修改。