單莉杰， 李 壯， 鄭大浩， 吳委林

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

玉米是世界上分布最廣的作物之一，2015年我國玉米種植面積達(dá)3 811.93萬hm2，產(chǎn)量為2.25億t，是我國第1大糧食作物[1-2]。玉米中除淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪外，還含有鈣、谷胱甘肽、核黃素和胡蘿卜素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，有極高的營養(yǎng)價(jià)值[3]。玉米彎孢菌葉斑病是繼玉米大斑病、小斑病的一種新型病害，主要危害植株葉片、葉鞘和苞葉，在玉米各生育期內(nèi)均可發(fā)生，一般減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重可減產(chǎn)50%以上，甚至絕收[4-5]，嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量與質(zhì)量。

彎孢菌(Curvularialunata)通過分泌聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)和纖維素酶(Cx)等多種細(xì)胞壁降解酶，破壞植物的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等防御組織，使植株葉片產(chǎn)生圓形或橢圓形病斑，造成葉片大面積壞死[6]。植物在遭受彎孢菌侵染后，體內(nèi)可產(chǎn)生苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)等多種防御酶。其中，PAL催化苯丙氨酸脫氨基后產(chǎn)生肉桂酸，最終轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素；POD催化脂肪族芳香胺和酚類氧化，是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶[7]。而木質(zhì)素是植物木質(zhì)部細(xì)胞壁的主要成分，Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，eIF5A基因在木質(zhì)部形成過程中起重要作用，還可直接參與病原真菌的侵染[9]，延緩葉片衰老[10]，提高氧化脅迫抗性[11]。因此，推測(cè)eIF5A基因與玉米抗彎孢菌侵染密切相關(guān)。

該研究以玉米彎孢菌抗性自交系Mo17和感性自交系黃早四為材料，分別克隆出Mo17和黃早四的eIF5A基因，并通過生物信息學(xué)手段比較分析兩者之間的序列與蛋白質(zhì)構(gòu)象差異，為玉米eIF5A基因?qū)濇呔剐缘难芯康於ɡ碚摶A(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取玉米彎孢菌抗性自交系Mo17和感性自交系黃早四種子，播種在農(nóng)學(xué)院教學(xué)實(shí)驗(yàn)基地，待玉米長(zhǎng)出完整的3片葉時(shí)，選取頂部第3片葉為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與cDNA合成

取0.1 g新鮮玉米葉片，加入液氮充分研磨，利用RNA simple 總RNA試劑盒，按照試劑盒說明書操作，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系(20 μL)為：5×FastKing-RT SuperMIx 4 μL，Total RNA 50 ng～2 μg，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?2 ℃ 15 min，85 ℃ 3 min。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA在-20 ℃冷凍保存，備用。

1.2.2 基因克隆與測(cè)序

通過以玉米標(biāo)準(zhǔn)基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.maizegdb.org)上的eIF5A基因的cDNA序列，以此序列為基礎(chǔ)利用Primer Premier 6.0S設(shè)計(jì)引物，其中正向引物為eIF5A F58:5’-GGATCGCCATGTCGGACT-3’,反向引物為eIF5A R745:5’-GGGCATAAAAGCATAGAAAATAC-3’。

PCR擴(kuò)增參照Promega PCR系試劑盒說明書。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，56.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸300 s。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，與pMD19-T進(jìn)行連接，再導(dǎo)入到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，在含有氨芐青霉素、IPTG、X-Gal的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，利用藍(lán)白斑篩選，選擇陽性菌落(白色)。酶切驗(yàn)證正確后，送到上海生工公司測(cè)序。

1.2.3 序列同源性分析

利用DNAStar和GenDoc2.0軟件對(duì)目標(biāo)氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析和序列分析，在NCBI下載禾本科eIF5A蛋白序列并利用MEGA 7軟件采用最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

目標(biāo)DNA序列編碼的蛋白質(zhì)序列分析，利用NCBI在線工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源比對(duì)；利用在線工具ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)和ProtScale(http://ca.expasy.org/tools/protscale.html)對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行理化性質(zhì)及親疏水性等一級(jí)結(jié)構(gòu)分析；利用在線工具TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對(duì)蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析；利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 eIF5A基因序列分析

從玉米抗病自交系Mo17和感病自交系黃早四中成功克隆并分離得到完整的含有目的基因的cDNA片段，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)從Mo17中克隆得到的eIF5A基因序列與已公布的eIF5A基因序列(登錄號(hào)為NM_001112136.1)相似性達(dá)100%。證實(shí)所得序列為玉米eIF5A基因。從Mo17中分離的片段長(zhǎng)度為688 bp，從黃早四分離的片段長(zhǎng)度為690 bp，2種自交系均具有完整的開放閱讀框(圖1)，均編碼160個(gè)氨基酸(圖2)。進(jìn)一步序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)二者堿基序列存在32處突變，其中，ORF內(nèi)發(fā)生2處替換突變；3’端發(fā)生28處替換突變和2處插入突變。蛋白質(zhì)序列存在1個(gè)區(qū)別，即第146的M蛋氨酸變?yōu)镮異亮氨酸。

圖1 玉米自交系Mo17和黃早四的基因序列比較

圖2 玉米自交系Mo17和黃早四編碼蛋白質(zhì)比較

2.2 目標(biāo)序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

利用在線工具(http://www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html)、ProtParam、ProtScale和TMHMM Server v.2.0對(duì)蛋白質(zhì)信號(hào)肽(圖3)、親疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)(圖4)進(jìn)行分析比對(duì)[12]。結(jié)果顯示，抗病材料Mo17和感病材料黃早四所含有疏水性氨基酸與親水性氨基酸殘基數(shù)相同，其中，疏水性氨基酸殘基54個(gè)，親水性氨基酸殘基106個(gè)，但異亮氨酸(I)和甲硫氨酸(M)在Mo17中所占比率分別為6.2%和1.2%，在黃早四中所占比率分別為6.9%和0.6%。eIF5A基因編碼氨基酸在Mo17和黃早四中相對(duì)分子量分別為17.50 KD和17.48 KD，總元素?cái)?shù)量分別為2 442和2 444，除N元素和O元素?cái)?shù)量相同外，其余C、H、S 3種元素在數(shù)量上均有差異，分別為760、1 215、6和761、121 7、5。理論等電點(diǎn)(PI)均為5.61，有25個(gè)負(fù)電荷殘基(Asp + Glu)和19個(gè)正電荷殘基(Arg+Lys)，總平均親疏水性分別為-0.487和-0.471，不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)為30.31(<40)，所以該基因編碼的蛋白質(zhì)為推斷穩(wěn)定的親水性蛋白。該蛋白在Mo17和黃早四2種材料中均無信號(hào)肽，且無跨膜區(qū)域結(jié)構(gòu)，說明該蛋白為非跨膜蛋白。

圖3 Mo17和黃早四的eIF5A信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖4 Mo17和黃早四的eIF5A跨膜結(jié)構(gòu)分析

2.2.2 蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線軟件SOPMA軟件對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)得到以下信息(表1)，該蛋白在Mo17和黃早四中均由α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲2部分構(gòu)成，延伸鏈數(shù)目相同，均為36，無規(guī)則卷曲在氨基酸總數(shù)中所占比例較大，分別為49.38%和46.88%，β轉(zhuǎn)角為7.50%和6.25%，所占比率最小。圖5更為直觀地表明eIF5A蛋白在2種材料中二級(jí)結(jié)構(gòu)存在的差異。

表1 Mo17和黃早四eIF5A蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)差異

注：A為α-螺旋；B為無規(guī)則卷曲；C為β轉(zhuǎn)角；D為延伸鏈

通過在線工具SWISS-MODEL建立蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型[13]，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖6)，得到下面的三維結(jié)構(gòu)立體圖，由于Mo17和黃早四在堿基序列上的差異，導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)有所不同。

圖6 Mo17和黃早四eIF5A蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)差異

2.2.3eIF5A蛋白同源性分析及進(jìn)化樹

在NCBI在線工具上下載與eIF5A相似性高的序列并利用MEGA 7軟件構(gòu)建玉米(Mo17和Huangzao4)、高粱(XP_002463132.2)、黍(XP_025800571.1)、粟米(RLM84934.1)、谷子(XP_004958204.1)、疣粒野生稻(KAF0907150.1)、粗山羊草(ABB29986.1)、擬鵝觀草(ABB90157.1)、長(zhǎng)穗偃麥草(ABB90158.1)、光稃旱麥草(ABB90159.1)、節(jié)節(jié)麥(ABB90160.1)、普通小麥(AAZ95172.1)、黑麥(ABB90161.1)、新麥草(ABB90162.1)、簇毛麥(ABB90164.1)的進(jìn)化樹(圖7)。結(jié)果表明，玉米與其他禾本科植物進(jìn)化樹分為3支，玉米與疣粒野生稻、谷子、黍、粟米、高粱為1支，光稃旱麥草、普通小麥、粗山羊草、節(jié)節(jié)麥、黑麥、長(zhǎng)穗偃麥草、簇毛麥為第1支，擬鵝觀草、新麥草為第2支，其中，玉米與高粱的親緣關(guān)系最近。

圖7 eIF5A與其他植物氨基酸序列進(jìn)化樹

2.2.4 磷酸化位點(diǎn)分析

用在線工具NetPhos3.1預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)(圖8，9)，可觀察到Mo17和黃早四的eIF5A磷酸化位點(diǎn)均有15個(gè)，且磷酸化位點(diǎn)一致，其中，Ser有8個(gè)、Thr有6個(gè)、Tyr有1個(gè)。Ser磷酸化位點(diǎn)為Ser 2、Ser 4、Ser 11、Ser 18、Ser 47、Ser 79、Ser 108、Ser 134；Thr磷酸化位點(diǎn)為Thr 20、Thr 27、Thr 48、Thr51、Thr 107、Thr 112；Tyr磷酸化位點(diǎn)為Tyr 92。

圖8 Mo17 eIF5A蛋白的磷酸化位點(diǎn)

圖9 黃早四eIF5A蛋白的磷酸化位點(diǎn)

2.2.5eIF5A蛋白的功能預(yù)測(cè)

利用NCBI在線工具對(duì)eIF5A蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)[14]，結(jié)果顯示Mo17和黃早四eIF5A基因編碼的蛋白質(zhì)均有1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域位于第2～160位氨基酸之間，屬于PLN103107超級(jí)家族(圖10，11)。

圖10 Mo17 eIF5A蛋白的功能

圖11 黃早四eIF5A蛋白的功能

3 討論與結(jié)論

eIF5A基因在動(dòng)植物和真菌體內(nèi)普遍存在，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞衰老、抵御外界生物脅迫及非生物脅迫的功能[15-19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，eIF5A基因在NaCl、NaHCO3等非生物脅迫下可增強(qiáng)POD、SOD等防御酶活性，提高葉綠素含量[20-21]。而植物在遭受彎孢菌侵染后，植株通過葉片壞死，體內(nèi)防御酶活性升高，有效清除活性氧，使植株免受活性氧的傷害。揭示了eIF5A基因在彎孢菌抗性中發(fā)揮重要作用，推測(cè)eIF5A基因通過提高多種防御酶活性提高植物的抗病能力。該研究選用玉米彎孢菌抗性自交系Mo17和感性自交系黃早四為材料，克隆出的玉米eIF5A基因片段分別為688和690 bp，在ORF內(nèi)有2處堿基替換突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象發(fā)生改變，同時(shí)3’UTR存在多處堿基突變，所編碼的蛋白質(zhì)為非跨膜穩(wěn)定的親水性蛋白，含有15個(gè)磷酸化位點(diǎn)，與其他禾本科植物同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列的一致性較高，說明eIF5A蛋白在禾本科植物中功能較為保守。

該研究中，Mo17與黃早四的eIF5A基因在3’UTR存在多處堿基突變，結(jié)合前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗病自交系魯原92和78599-1受彎孢菌侵染后eIF5A蛋白表達(dá)量升高，而感病自交系E28和黃早四的eIF5A蛋白表達(dá)量沒有變化[22]，暗示了可能存在相關(guān)miRNA通過調(diào)控eIF5A基因的表達(dá)影響玉米抵抗彎孢菌侵害的作用；而ORF內(nèi)的2處堿基替換突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象發(fā)生改變是否會(huì)影響玉米對(duì)彎孢菌的抗性還需進(jìn)一步深入研究。