全英杰， 蔡永亮， 岳圓圓， 任鏝蓉， 高 日*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院；2.延邊林業(yè)綠化有限公司:吉林 延吉 133002)

溫度是限制植物分布的重要因素，低溫條件下，植物不能正常生長發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)甚至致死。植物在受到低溫脅迫后，可以通過改變生理?xiàng)l件來提高耐寒性[1]。植物受到低溫脅迫時(shí)，活性氧(ROS)和自由基含量增加，損傷膜系統(tǒng)，破壞細(xì)胞空間結(jié)構(gòu)，使自身代謝平衡紊亂[2]。植物在逆境條件下，其體內(nèi)通過一系列的生化反應(yīng)來降低受到的傷害[3]。超氧化物歧化酶是一種可以消除生物體新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)的重要保護(hù)酶[4]。低溫脅迫時(shí)，植物體內(nèi)SOD含量上升，將自由基還原成水和氧分子，清除植物內(nèi)活性氧，維持代謝平衡[5]。黎瑞珍等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在逆境條件下，植物能產(chǎn)生SOD清除O2-產(chǎn)生的毒害，提高耐寒性。過氧化物酶是一類廣泛存在于植物體內(nèi)用來清除逆境下細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧自由基的酶，可抑制過氧化反應(yīng)，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性[7]，從而減輕逆境帶來的傷害[8]。伍寶朵等[9]研究發(fā)現(xiàn)，胡椒會(huì)通過提高抗氧化酶來抵御低溫傷害。丙二醛的含量可以間接衡量植物的耐寒性，杜鑫宇等通過測(cè)定不同煙草品種苗期MDA含量研究持續(xù)低溫脅迫下煙草耐寒性生理指標(biāo)[10]。

膜系統(tǒng)是植物受低溫脅迫的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，低溫脅迫下可通過植物細(xì)胞電解質(zhì)滲出的多少間接了解植物受傷的程度[11]。在自由基的影響下，細(xì)胞不飽和酸發(fā)生質(zhì)膜過氧化生成丙二醛，產(chǎn)生毒性增大膜透性，使其流動(dòng)性減弱，因此，丙二醛的量可以反映細(xì)胞膜損傷的程度，逆境傷害時(shí)其含量會(huì)增加[12]，可以根據(jù)其含量的變化表現(xiàn)植物的耐寒能力。

地被菊(ChaysanthemummorifoliumRamat.Tzve)為菊科菊屬多年生草本植物，是中國傳統(tǒng)花卉之一，植株矮小，花型緊湊，品種較多，花色有紅色、黃色和粉色等，花期8～10月份[13]，被廣泛應(yīng)用于廣場(chǎng)、公園、街道以及各類園林綠地中。地被菊對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，廣泛分布在華南、華中和華北等地區(qū)，由于環(huán)境條件的限制，僅有少部分品種可以在東北地區(qū)栽培，目前地被菊“金陵”、“鐘山”和“雨花”等品種已在遼寧地區(qū)成功引種[14]，而在延邊地區(qū)適合栽培地被菊品種未見報(bào)道。因此，該試驗(yàn)以13個(gè)地被菊品種葉片為材料，通過測(cè)定半致死溫度，對(duì)耐寒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)在5 ℃與20 ℃條件下對(duì)4個(gè)高耐寒品種的SOD和POD酶活性，MDA含量進(jìn)行比較，以期篩選出適宜在延邊地區(qū)生長的地被菊品種，為研究菊花耐寒性機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從南京農(nóng)業(yè)大學(xué)菊花種質(zhì)資源庫引進(jìn)“錦靈之風(fēng)”、“錦靈千尋”、“錦靈靛翠”、“錦靈柔柳”、“錦靈柔驕”、“映潔玉桂”、“映潔月桂”、“映潔櫻桂”、“映潔紫驕”、“映潔紫寇”、“靖山赤驕”和遼寧引進(jìn)的“映潔紅菲”和“靖山紫花”共13個(gè)地被菊品種，在延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院教學(xué)基地中分別扦插繁殖。

1.2 方法

1.2.1 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定

不同品種的地被菊長到15 cm高時(shí)，在不同溫度下處理2 h，處理溫度分別為15、10、5、0和-5 ℃，取頂部葉片5枚用于試驗(yàn)材料。將處理后的葉片剪成邊長為1 cm的小方塊，用電子天平稱取1 g左右放入裝有20 mL去離子水的試管中，靜置2 h后用電導(dǎo)率儀(DDS 307型)測(cè)定初電導(dǎo)值C1，然后在沸水中煮沸15 min，冷卻靜置后測(cè)定終電導(dǎo)值C2，得到相對(duì)電導(dǎo)率，為C1/C2×100%[15]。以電導(dǎo)率值和相應(yīng)處理溫度擬合Logistic回歸方程 y=k/(1+ae-bx)。依據(jù)方程得到參數(shù)a、b,根據(jù) LT50=-lna/b求出半致死溫度(LT50)[16]。式中,y為相對(duì)電導(dǎo)率,x為處理溫度/℃，a、b為方程參數(shù)，k為曲線漸近線，即細(xì)胞最大電解質(zhì)透出率(a、b、k>0)。

1.2.2 POD和SOD酶活性、MDA含量測(cè)定

將地被菊“映潔玉桂”、“映潔紫驕”、“映潔紅菲”、“靖山紫花”進(jìn)行扦插，待幼苗長到15 cm高，含有6～8片葉子后進(jìn)行低溫處理，溫度設(shè)定為5和20 ℃，處理時(shí)間為2 h，每個(gè)處理重復(fù)3次。低溫處理后取頂部的2～3片葉片，測(cè)定MDA含量和SOD及POD活性。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法測(cè)定[17]，SOD活性采用NBT光還原法測(cè)定[17]，POD活性用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[17]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用SPSS 19.0軟件T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著差異性分析(顯著水平為0.05)，聚類分析采用K-Means。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種地被菊的半致死溫度

地被菊葉片在不同低溫下處理后測(cè)定其相對(duì)電導(dǎo)率值，得到相對(duì)電導(dǎo)率，根據(jù)擬合的Logistic方程，計(jì)算半致死溫度(表1)。不同品種地被菊半致死溫度為-1.39～-23.49 ℃，半致死溫度-20 ℃以下的品種有“映潔玉桂”、“映潔紫驕”、“映潔紅菲”、“靖山紫花”。其中，“映潔玉桂”半致死溫度最低為-23.49 ℃；半致死溫度為-5 ℃以上的地被菊品種主要有“錦靈之風(fēng)”、“錦靈千尋”、“錦靈柔柳和“映潔月桂”。

表1 不同品種地被菊相對(duì)電導(dǎo)率回歸方程及半致死溫度

2.2 不同品種地被菊耐寒性聚類分析

采用K-Means聚類分析法根據(jù)半致死溫度將13個(gè)品種劃分為3個(gè)等級(jí)(表2)，耐寒性強(qiáng)的品種有“映潔玉桂”、“映潔紫驕”、“映潔紅菲”、“靖山紫花”，其平均半致死溫度約為-22.15 ℃。“錦靈靛翠”、“錦靈柔驕”、“映潔紫寇”為第2類耐寒品種，其平均半致死溫度為-12.28 ℃。耐寒性較弱的品種有“錦靈之風(fēng)”、“錦靈千尋”、“錦靈柔柳”、“映潔月桂”、“映潔櫻桂”、“靖山赤驕”，其平均半致死溫度為-4.19 ℃。

表2 耐寒性聚類分析

2.3 低溫條件下高耐寒品種地被菊POD活性變化

低溫對(duì)高耐寒地被菊品種POD活性有較大的影響，在5 ℃條件下，地被菊“映潔玉桂”、“映潔紫驕”、“映潔紅菲”、“靖山紫花”POD活性比對(duì)照分別提高了2.19倍、2.10倍、2.97倍、1.57倍，并且呈極顯著差異(圖1)。

圖1 低溫條件下高耐寒品種地被菊POD活性變化

2.4 低溫條件下高耐寒品種地被菊SOD活性變化

高耐寒地被菊低溫處理后，SOD活性的變化如圖2。其中，“映潔紫驕”，5 ℃時(shí)的SOD活性為203.6 U/g.FW，比對(duì)照提高了16倍多。“映潔玉桂”、“映潔紅菲”、“靖山紫花”5 ℃時(shí)的SOD活性也均高于對(duì)照處理組，且均呈顯著差異性。

圖2 低溫條件下高耐寒品種地被菊SOD活性變化

2.5 低溫條件下高耐寒品種地被菊MDA含量變化

低溫處理高耐寒地被菊品種發(fā)現(xiàn)，不同品種間MDA含量變化不同(圖3)，其中,變化最小的是“靖山紫花”，MDA含量在低溫處理時(shí)僅上升0.2 U/mg.FW，而“映潔紫驕”，MDA含量在低溫處理時(shí)上升2.0 U/mg.FW，高耐寒地被菊品種5 ℃處理，MDA含量與對(duì)照相比變化不大，有略微升高但均無顯著差異。

圖3 低溫條件下高耐寒品種地被菊MDA含量變化

3 討論與結(jié)論

植物受到低溫脅迫后，細(xì)胞質(zhì)膜透性發(fā)生變化，通過測(cè)定電導(dǎo)率計(jì)算半致死溫度，可直接反應(yīng)耐寒性。趙秀梅[18]測(cè)定8個(gè)桃品種的耐寒性，結(jié)果表明，半致死溫度與枝條恢復(fù)生長驗(yàn)證的結(jié)果基本吻合。該試驗(yàn)中“映潔玉桂”、“映潔紫驕”、“映潔紅菲”、“靖山紫花”半致死溫度分別為-23.49、-23.48、-21.00和-20.61 ℃，耐寒性較高。在切花菊中，通過測(cè)定半致死溫度，篩選出南農(nóng)金檸檬、Qx097、QD028、Qx049、Qx153和Qx008等6個(gè)耐寒性強(qiáng)的品種資源，并且都得到驗(yàn)證[19]。生理指標(biāo)也能反映植物的抗性，張春蘭等通過測(cè)定不同基因型大豆SOD和POD活性對(duì)耐鹽性進(jìn)行篩選[20]，白冰等通過測(cè)定雞冠花SOD和POD的含量，研究逆境脅迫下雞冠花的生理變化[21]。當(dāng)外界低溫超過植物自身的臨界值，植物體內(nèi)保護(hù)酶(SOD和POD)含量會(huì)迅速下降甚至消失，當(dāng)外界低溫在植物自身保護(hù)的臨界值內(nèi)，酶能做出反應(yīng)來減少低溫對(duì)植物造成的傷害。該試驗(yàn)中“映潔玉桂”、“映潔紫驕”、“映潔紅菲”和“靖山紫花”POD與SOD酶活性在低溫時(shí)均顯著高于對(duì)照。MDA是植物膜質(zhì)過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，在一定溫度范圍內(nèi)，低溫脅迫程度越大，植物積累的MDA越多。研究發(fā)現(xiàn)地被菊MDA含量變化隨溫度降低而增加，MDA會(huì)增大細(xì)胞的膜透性，對(duì)細(xì)胞膜有毒害作用。楊鳳翔[22]研究不同品種草莓耐寒性發(fā)現(xiàn)，耐寒性弱的品種MDA含量更高。楊捷等[23]研究天目瓊花和花葉錦帶耐寒發(fā)現(xiàn)，MDA含量與耐寒性呈負(fù)相關(guān)。在低溫處理下“映潔玉桂”、“映潔紫驕”、“映潔紅菲”和“靖山紫花”MDA含量變化都較小，也體現(xiàn)它們的耐寒性較高。該研究中“映潔玉桂”、“映潔紫驕”、“映潔紅菲”和“靖山紫花”在低溫處理下SOD與POD酶活性都顯著增高，且半致死溫度都低于-20 ℃，為耐寒性較強(qiáng)的地被菊品種。