張 泰， 李抒柏， 高 暢， 金英海*， 楊立彬

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；2.北京君德同創(chuàng)農(nóng)牧科技股份有限公司,北京 100089)

胍基乙酸是合成肌酸的前體物[1-2]，主要存在于肌細(xì)胞中，為機體提供能量，但很多外源性肌酸價格昂貴且不穩(wěn)定。胍基乙酸中含有的高能磷酸基團是肌肉組織中的主要供能物質(zhì)。中藥源于自然界，具有抗應(yīng)激功能、提高機體免疫機能等特點[3]，作為飼料添加劑具有資源豐富、毒副作用小、無耐藥性、多靶點、多功效等獨特優(yōu)勢[4]。

近年來，抗生素的大量使用導(dǎo)致畜產(chǎn)品中的殘留問題，而中草藥低毒無殘留的優(yōu)點，成為飼料添加劑研究的又一方向。為研究胍基乙酸中藥制劑的安全性，該試驗通過對小鼠灌胃不同劑量的胍基乙酸中藥制劑，觀察小鼠精神狀況，對臟器指數(shù)和血清生化指標(biāo)進(jìn)行分析，為胍基乙酸中藥制劑的后續(xù)開發(fā)應(yīng)用提供參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1)受試物制備 將胍基乙酸(≥96.0%，占整添加劑的12%，由固安均德同創(chuàng)生物工程有限公司提供)、蛋氨酸(≥99%，占添加劑的4%，由贏創(chuàng)蛋氨酸有限公司提供)、紅棗、山楂、陳皮、白術(shù)(均亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司提供)，粉碎過40目篩，按一定比例配制成胍基乙酸中藥制劑。

2)試驗動物 選用體質(zhì)量在(20±2)g, 體況良好、健康的昆明小鼠，60只(雌雄各半)，購自延邊大學(xué)動物實驗中心。

1.2 方法

小鼠在試驗環(huán)境中適應(yīng)1 d后，按體重將小鼠隨機分為對照組和不同劑量的試驗組(500、1 000、2 000、4 000和8 000 mg/kg)，每組10只(雌雄各半)，給藥開始前禁食不禁水12 h，1次灌服給藥，4 h后正常飼喂。對照組給等量生理鹽水，給藥后連續(xù)觀察4 h，其余時間每天觀察3次，小鼠精神狀況，連續(xù)觀察7 d。對小鼠進(jìn)食狀況、飲水情況、有無出現(xiàn)異?；顒印⒂袩o異常肌肉運動、對外界刺激的反應(yīng)等毒性反應(yīng)情況和死亡情況進(jìn)行詳細(xì)記錄，觀察結(jié)束后，處死動物并解剖，觀察小鼠的臟器。

1.3 測定指標(biāo)

1)觀察指標(biāo) 對小鼠進(jìn)食狀況、飲水情況、有無出現(xiàn)異?；顒?、有無異常肌肉運動、對外界刺激的反應(yīng)等毒性反應(yīng)進(jìn)行觀察。

2)臟器比 小鼠脫頸椎處死稱重，解剖取脾臟、腎臟、肝臟等臟器稱重，記錄并計算各臟器的臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)/% =臟器質(zhì)量/體重×100%。

3)血清生化指標(biāo) 采用眼球取血的方法，將血液靜止30 min后3 000 r/min離心10 min，用移液將血清上清液槍分離，在-20 ℃保存?zhèn)溆?。谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)采用天冬氨酸底物法、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)采用丙氨酸底物法測定、堿性磷酸酶(ALP)采用NPP底物-AMP緩沖液法測定、總抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)采用比色法測定、過氧化氫酶活力(CAT)采用比色法測定、丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法測定、超氧化物歧化酶(SOD)采用黃嘌呤氧化物酶法測定。采用試劑盒及檢測結(jié)果均來自北京華英生物科技研究所。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件中的ANOVA分析試驗數(shù)據(jù)，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P<0.01，表示差異極顯著，P<0.05，表示差異顯著，P>0.05，表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 胍基乙酸中藥制劑對小鼠毒性癥狀觀察

給藥一段時間后，小鼠未出現(xiàn)怠動、嗜睡等現(xiàn)象，進(jìn)食和飲水情況正常，無異常活動，對外界刺激反應(yīng)正常，大劑量給藥后，小鼠出現(xiàn)短暫的休息調(diào)整行為，后恢復(fù)正常行為，試驗期間無小鼠死亡(表1)。

表1 胍基乙酸中藥制劑對小鼠灌胃后死亡情況

2.2 胍基乙酸中藥制劑對小鼠臟器指標(biāo)的影響

由表2可知，與對照組相比，不同劑量試驗組的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)變化不明顯，但數(shù)值在一定劑量范圍內(nèi)隨著灌胃劑量的增加而增加(P>0.05)。

表2 胍基乙酸中藥制劑對小鼠臟器指標(biāo)的影響

2.3 胍基乙酸中藥制劑對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，與對照組相比，各試驗組AST指標(biāo)極顯著降低(P<0.01)；試驗2、3、4組ALT相對于對照組均極顯著降低(P<0.01)，試驗1、5組ALT低于對照組但差異不顯著(P>0.05)；各試驗組ALP均低于對照組(P<0.01)。

表3 胍基乙酸中藥制劑對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

2.4 胍基乙酸中藥制劑對小鼠抗氧化指標(biāo)的影響

與對照組相比，試驗2、3、5組T-AOC指標(biāo)差異極顯著(P<0.01)；與對照組相比，試驗1、2、3組GSH-PX極顯著增加(P<0.01)；試驗2、3、4組與對照組相比,CAT極顯著增加(P<0.01)，同樣與試驗1、5組相比，極顯著增加(P<0.01)；與對照組相比，試驗2、3組MDA極顯著降低(P<0.01)；各試驗組SOD與對照組相比，均差異極顯著(P<0.01)。

表4 胍基乙酸中藥制劑對小鼠抗氧化指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 胍基乙酸中藥制劑對小鼠毒性癥狀

急性毒性試驗:是1次投給實驗動物較大劑量的受試物, 觀察其在短時期(一般為24 h～2周以內(nèi))中毒反應(yīng)的一種試驗方法[5]。該試驗通過設(shè)置5個不同的灌胃劑量，不同劑量組小鼠精神狀況正常，未出現(xiàn)死亡情況，判斷胍基乙酸中藥制劑無毒。

3.2 胍基乙酸中藥制劑對小鼠臟器指標(biāo)的影響

動物內(nèi)臟器官的正常發(fā)育是實現(xiàn)各項生理機能的前提, 器官指數(shù)和腸道指數(shù)可反映機體組織器官的生長發(fā)育情況[6]。可以通過臟器指數(shù)的大小, 反應(yīng)病理情況和功能強弱[7]。當(dāng)試驗物導(dǎo)致臟器損傷時會導(dǎo)致臟器指數(shù)發(fā)生變化[8]。據(jù)報道，灌胃后小鼠肝臟、腎臟指數(shù)差異不顯著，表明無急性毒性作用[9]。該試驗灌胃不同劑量的胍基乙酸中藥制劑后，小鼠各種臟器指數(shù)均差異不顯著，但臟器指數(shù)在一定范圍內(nèi)隨著給藥劑量的增加而增加，說明一定劑量的胍基乙酸中藥制劑對免疫系統(tǒng)存在一定作用。

3.3 胍基乙酸中藥制劑對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

AST、ALT分別是存在于動物組織細(xì)胞胞液和線粒體中重要的氨基轉(zhuǎn)移酶, 當(dāng)動物機體肝臟受到損傷時, 這些酶會釋放到血液中引起血液中2種酶活性的升高[10]。肝臟是體內(nèi)重要的解毒器官, 當(dāng)肝臟受到損傷時, 導(dǎo)致動物機體物質(zhì)代謝異常、紊亂等, 血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量增加[11]。該試驗結(jié)果顯示，隨著胍基乙酸中藥制劑灌胃劑量的增加，AST、ALT、ALP指標(biāo)先降低后增加，但整體低于對照組，表明胍基乙酸中藥制劑對肝臟和心臟具有保護(hù)作用。

3.4 胍基乙酸中藥制劑對小鼠抗氧化指標(biāo)的影響

機體的抗氧化狀態(tài)在維持動物健康、生長性能和繁殖性能方面都有著重要作用[12]。動物機體的抗氧化狀態(tài)必須保持一定的平衡, 過高或過低都會影響機體健康[13]。SOD是機體重要的抗氧化酶, 在清除過氧化物和保護(hù)細(xì)胞免于氧化損傷中起重要作用[14]。GSH-PX及CAT將H2O2分解為水和氧,并防止羥基自由基的形成[15]。MDA是脂質(zhì)過氧化標(biāo)志，反應(yīng)機體過氧化程度[16]。日糧中添加中草藥或者中草藥組方可以增強畜禽機體的抗氧化功能, 進(jìn)而提高機體的免疫水平[17]。該試驗結(jié)果顯示，隨著胍基乙酸中藥制劑灌胃劑量的增加，總抗氧化能力、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶指標(biāo)先增加后降低但整體水平高于對照組；丙二醛指標(biāo)先降低后上升，但整體水平低于對照組，表明胍基乙酸中藥制劑具有抗氧化作用。

4 結(jié)論

綜合小鼠精神狀況、死亡數(shù)量和臟器指數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)胍基乙酸中藥制劑無毒性，安全。通過對血清指標(biāo)分析，發(fā)現(xiàn)胍基乙酸中藥制劑具有抗氧化、保護(hù)肝臟的作用，為胍基乙酸中藥制劑在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。