劉素欣， 張 露， 崔承弼

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

近年來(lái)，隨著人們的膳食結(jié)構(gòu)、飲食習(xí)慣和生活方式發(fā)生的巨大變化，糖尿病已經(jīng)成為第3位嚴(yán)重危害人類健康的慢性常見(jiàn)病[1]。一般分為Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、妊娠糖尿病和繼發(fā)性糖尿病[2]。

Ⅰ型糖尿病，是一種需終生選擇外用胰島素治療，以防代謝失償和酮癥酸中毒的自身免疫性疾病[3-4]，且不易被發(fā)現(xiàn)，一般待確診時(shí)，該病已潛伏發(fā)作一段時(shí)間了[5]。傳統(tǒng)西藥見(jiàn)效快，但長(zhǎng)期服用會(huì)使人體產(chǎn)生不良反應(yīng)，而我國(guó)中藥資源豐富，歷史悠久，療效穩(wěn)定且不良反應(yīng)小，應(yīng)用前景廣闊[6]。作為我國(guó)長(zhǎng)白山地區(qū)一味功效甚好的中醫(yī)藥材—紅景天，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于保健品、美容護(hù)膚和醫(yī)藥研發(fā)等領(lǐng)域，國(guó)家衛(wèi)生部1991年將其批準(zhǔn)為食品新資源[7]。

紅景天(RhodiolaRosea)為多年生草本植物，生長(zhǎng)在海拔3 000 m的高原地區(qū)，有“高原人參”之稱[8]?！毒е楸静荨分杏涊d：“大株紅景天治瘟病時(shí)疫，清肺熱，治脈病”是藏醫(yī)臨床常用藥材，因其生長(zhǎng)環(huán)境惡劣，故具有很強(qiáng)的生命力和適應(yīng)能力。紅景天提取物的主要成分為紅景天苷、絡(luò)塞維、沒(méi)食子酸、酪醇等活性物質(zhì)[9]，常用于評(píng)價(jià)紅景天的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，紅景天提取物可通過(guò)改善肺血管通透性來(lái)保護(hù)小鼠急性肺損傷[10]，以調(diào)節(jié)AMPK信號(hào)途徑來(lái)控制肝糖原異生進(jìn)而降低血糖[11]。

故該試驗(yàn)選擇紅景天提取物對(duì)糖尿病小鼠進(jìn)行治療，研究不同濃度紅景天提取物對(duì)糖尿病小鼠的降糖效果，以及其糖耐量、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、糖化血紅蛋白(GHb)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平、臟器系數(shù)等相關(guān)指標(biāo)的影響，旨在探索紅景天提取物的降血糖作用，從而為糖尿病臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

1)材料：高山紅景天(由長(zhǎng)白山科學(xué)研究院提供)。

2)試劑：70%乙醇；檸檬酸、檸檬酸鈉：AR級(jí)(購(gòu)于天津華東試劑廠);鏈脲佐菌素(STZ)：純度≥98%(HPLC)(美國(guó)SIGMA公司)；鹽酸二甲雙胍片：純度以C4H22N5·HCL計(jì)0.5 g/片(天方藥業(yè)有限公司)；NaCl注射液(0.9%)(吉林康乃爾藥業(yè)有限公司)；葡萄糖粉劑(廣西梧州制藥有限公司)。

3)試劑盒：總膽固醇(T-CHO)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、糖化血紅蛋白(GHb)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京市建成生物研究所)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)昆明種小鼠30只，體重20～22 g左右，雄性，由延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。于室溫(20～25 ℃)、相對(duì)濕度(50±5)%的延邊大學(xué)食品研究中心動(dòng)物室內(nèi)適應(yīng)7 d，自由攝食和飲水，多籠飼養(yǎng)?；A(chǔ)飼料由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

落地式連續(xù)投料粉碎機(jī)DF-35型(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；電熱恒溫水浴鍋HWS-24型(上海百典儀器設(shè)備有限公司)；離心機(jī)TG16A-WS型(上海盧湘儀器有限公司)；實(shí)驗(yàn)型冷凍干燥機(jī)LyoQuest-55型(西班牙Telstar集團(tuán)公司)；真空泵DTC-22B型(日本ULUACKIKO公司)；冷凝器CCA-1111-CE型(東京理化器械株式會(huì)社)；渦旋混勻器MS3basic無(wú)空格型(德國(guó)IKA集團(tuán));1 mL 1次性無(wú)菌注射器(上海金塔醫(yī)用器材有限公司);血糖儀AG-605型(天津市九安醫(yī)療公司)。

1.2 方法

1.2.1 紅景天預(yù)處理及提取

1)預(yù)處理：將紅景天根莖粉碎處理后，在干燥箱中80 ℃烘干，過(guò)60目篩，得到紅景天粉末。

2)紅景天提取物的提?。河?0%乙醇按照料液比1∶10的比例，于80 ℃水浴中浸提1 h，冷卻至室溫后在離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心20 min，收集上清液，再次對(duì)沉淀物按上述步驟提取，共提取3次，將收集的上清液蒸發(fā)濃縮，濃縮液放入-80 ℃冰箱中進(jìn)行冷凍，后進(jìn)行冷凍干燥，并將最終提取物粉末密封保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 Ⅰ型糖尿病動(dòng)物模型的建立

鏈脲佐菌素(STZ)配制：將STZ分裝于1.5 mL EP管中，每管5 mg，用錫紙包裹。將檸檬酸與檸檬酸鈉按比例溶解配置成緩沖溶液(0.1 mol/L，pH值4.35)，將其溶解STZ配置成12 mg/mL注射液，振蕩搖勻，避光，冰浴保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

小鼠造模：對(duì)小鼠進(jìn)行為期1周的喂養(yǎng)以便其適應(yīng)環(huán)境，隨機(jī)選取30只，對(duì)所有小鼠正常飲水禁食12 h(晚8點(diǎn)到早8點(diǎn))后，禁食過(guò)夜，測(cè)量并記錄小鼠體重及空腹血糖水平，根據(jù)小鼠體重對(duì)其進(jìn)行1次性大劑量腹腔注射STZ，建立Ⅰ型糖尿病模型，其注射劑量為120 mg/kg·BW，濃度12 mg/mL，空白組同時(shí)腹腔注射檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液(0.1 mol/L，pH值4.35)，緩沖液做假性處理。每組小鼠在30 min內(nèi)完成注射，并在注射1 h后恢復(fù)自由進(jìn)食[12]。

在造模后第4天禁食過(guò)夜，稱重，并測(cè)量空腹血糖值，最終空腹血糖值大于11.1 mmol/mL確定為造模成功。成功即為Ⅰ型糖尿病小鼠，剔除未成功小鼠，并對(duì)未成功小鼠進(jìn)行再次建模[13]。

1.2.3 小鼠分組

小鼠造模成功后，將小鼠分為6組，糖尿病小鼠每天按不同紅景天提取物濃度進(jìn)行一次灌胃，根據(jù)小鼠體重變化調(diào)節(jié)給藥劑量，而空白組和模型組均灌以相同量的蒸餾水。紅景天濃度設(shè)置是在研究小鼠每日允許攝入量和參考相關(guān)試驗(yàn)[14]后進(jìn)行設(shè)計(jì)。

其具體分組及灌胃情況如下所示：

將小鼠隨機(jī)分為6組，每組5只，其中未得病的空白組灌以蒸餾水，而糖尿病小鼠的分組及灌胃情況如下：

模型組(蒸餾水)、陽(yáng)性組(鹽酸二甲雙胍500 mg/kg·BW)、高劑量組(紅景天提取物1 000 mg/kg·BW)、中劑量組(紅景天提取物500 mg/kg·BW)、低劑量組(紅景天提取物250 mg/kg·BW)。

1.2.4 動(dòng)物試驗(yàn)流程

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成功造模后，每天對(duì)其進(jìn)行灌胃給藥并且測(cè)體重、攝食量和飲水量，每周定期測(cè)定空腹血糖值，進(jìn)行為期4周的灌胃處理后，最后1次測(cè)定小鼠的空腹血糖值，并進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)，隔天禁食12 h后，對(duì)小鼠進(jìn)行眼球取血并且將血液收集在1.5 mL EP管中，取血后立即對(duì)小鼠進(jìn)行脫頸處死，立即將其解剖，取心、肝、脾、腎4個(gè)臟器，用0.9%氯化鈉溶液洗凈血液并吸干表面液體，稱重并記錄。血液離心處理后將血漿和血細(xì)胞分開(kāi)保存，備用；然后進(jìn)行指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.5 小鼠的理化指標(biāo)和生化指標(biāo)的測(cè)定

1)小鼠體重、攝食量、飲水量的測(cè)定：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每天測(cè)量并記錄體重、飲用水以及飼料的添加量和剩余量；造模成功后，再次測(cè)量體重并記錄；開(kāi)始灌胃后，每天測(cè)量體重、攝食量、飲水量變化并記錄。其中食物效價(jià)計(jì)算方法：食物效價(jià)=體重增量/攝食量

2)小鼠空腹血糖的測(cè)定：測(cè)定小鼠空腹血糖值時(shí)，取尾靜脈血，剪尾尖后棄第1滴血用第2滴血測(cè)定。

3)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)：最后1次灌胃后禁食12 h，經(jīng)口1次性灌胃大劑量葡萄糖溶液(劑量2 g/kg·BW)，分別測(cè)定小鼠0、30、60、90、120 min時(shí)的血糖水平。

4)臟器系數(shù)的測(cè)定：稱取解剖小鼠所得心、肝、脾和腎的重量，計(jì)算得臟器系數(shù)。

5)生化指標(biāo)的測(cè)定：取眼血和肝臟，冰浴保存，按照各試劑盒的使用方法進(jìn)行操作，測(cè)定吸光值，計(jì)算TC、TG、GHb、SOD、MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS25.0對(duì)所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)以圖表和均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(X±SD)的形式表示。P<0.05,表示差異性顯著，P<0.01,表示差異性極為顯著，P>0.05,表示無(wú)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅景天醇提法的提取率

紅景天粉末經(jīng)75%乙醇提取得到的紅景天提取物，提取率為30%。

2.2 紅景天提取物對(duì)小鼠基礎(chǔ)指標(biāo)的影響

紅景天提取物對(duì)小鼠體重及攝食飲水情況的影響見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)期間各組小鼠體重及攝食飲水情況(n=5)

造模成功后，經(jīng)4周的灌胃試驗(yàn)，對(duì)比觀察得到：空白組小鼠體重最重，高于注射STZ的各組小鼠，并存在顯著性差異(P<0.05)，隨著灌胃時(shí)間延長(zhǎng)，各給藥組小鼠體重均有增加，但仍低于正常組，因此，正常組食物利用率最高，而模型組食物利用率最低，給藥組隨著用藥劑量的增加食物利用率隨之提高，“三多一少”癥狀有所緩解。

空白組墊料干燥、毛色正常，沒(méi)有掉毛現(xiàn)象；而模型組墊料最濕，毛發(fā)枯黃粗糙、有掉毛現(xiàn)象；給藥組隨用藥劑量的提高，毛發(fā)逐漸由干燥變?yōu)槿犴?，禿毛現(xiàn)象也減輕，精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。

2.3 紅景天提取物對(duì)小鼠血液指標(biāo)的影響

2.3.1 對(duì)小鼠空腹血糖的影響

試驗(yàn)各組小鼠血糖變化見(jiàn)圖1。

注：與空白組比較，##表示P<0.01；與模型組比較，*表示P<0.05,**表示P<0.01，下同。

由圖1可知，在造模之前，所有小鼠體內(nèi)血糖濃度并無(wú)明顯差異，但在造模成功后，所有小鼠血糖量均高于11.1 mmol/L。開(kāi)始灌胃后，模型組血糖濃度逐漸上升，空白組相對(duì)穩(wěn)定，且與其他組血糖濃度有顯著差異(P<0.05)；給藥組血糖隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，其中，高劑量組血糖下降最快，與鹽酸二甲雙胍的降糖效果在一定程度上相近，說(shuō)明高劑量組降糖效果顯著，對(duì)小鼠降血糖具有輔助作用。

2.3.2 對(duì)小鼠糖耐量的影響

由圖2可知，在0～60 min，各組血糖濃度均呈上升趨勢(shì)，并且在60 min時(shí)達(dá)到峰值，在60～120 min，各組血糖濃度均呈下降趨勢(shì)。在60～90 min，所有給藥組血糖濃度均顯著低于模型組(P<0.05)，高劑量、中劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組血糖濃度急劇下降，并且下降趨勢(shì)與空白對(duì)照組相近。說(shuō)明高劑量和中劑量組對(duì)小鼠糖耐量的改善效果較好，表明其具有提高小鼠抗高血糖的能力。

圖2 不同給藥組劑量對(duì)各試驗(yàn)組小鼠糖耐量的影響

2.3.3 對(duì)小鼠血液TC、TG、GHb、MDA、SOD的影響

由表2可知，為紅景天提取物對(duì)小鼠血液TC、TG、GHb、MDA、SOD的影響?？瞻捉MTC、TG、GHb和MDA的含量最低，模型組的含量最高，并且給藥組隨提取物濃度的上升，TC、TG、GHb和MDA的含量逐漸下降，其中高劑量組與陽(yáng)性組的TC、TG、GHb和MDA值差異性不顯著(P>0.05)，但均低于中、低劑量組。

表2 紅景天提取物對(duì)TC、TG、GHb、MDA、SOD的影響

SOD含量在模型組中最低，空白組中最高，灌胃紅景天提取物的三組隨濃度的上升而上升。其中高、中、低劑量組與陽(yáng)性組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，與模型組有顯著性差異(P<0.05)。因此不同濃度的紅景天提取物能夠在一定程度上提高糖尿病小鼠抗氧化能力。

2.4 紅景天提取物對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

由表3可知，紅景天提取物對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響。從表3中可以看出，灌胃紅景天提取物的小鼠心臟臟器系數(shù)和脾臟臟器系數(shù)與空白組相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明紅景天提取物未對(duì)小鼠心臟和脾臟造成負(fù)擔(dān)。模型組的肝臟臟器系數(shù)和腎臟臟器系數(shù)顯著高于灌胃紅景天提取物的各組(P<0.05)，其中高劑量組和陽(yáng)性組肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)最為接近。因此，不同濃度紅景天提取物可有效緩解糖尿病小鼠的肝腎腫大現(xiàn)象，其中高劑量效果較好。

表3 紅景天提取物對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

3 討論與結(jié)論

據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的紅景天苷具有還原能力及有效清除自由基DPPH的活性，而紅景天提取物的作用優(yōu)于單體活性成分紅景天苷[15-16]，進(jìn)一步結(jié)合韓雪嬌等[17]對(duì)其治療糖尿病的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，紅景天提取物能夠通過(guò)增加血清胰島素緩解糖尿病并發(fā)癥，綜合表明，除紅景天苷外，紅景天提取物中的其他成分可能發(fā)揮其抗氧化及降血糖的主要作用。

在糖尿病患者中，由于胰島素的生物調(diào)節(jié)作用發(fā)生障礙，常伴有脂質(zhì)代謝的紊亂，出現(xiàn)血糖和血脂代謝異常，俗稱“高血脂”[18]。故在糖尿病患者中，由于胰島素調(diào)節(jié)作用不足而發(fā)生脂質(zhì)代謝異常，從而使機(jī)體內(nèi)TC、TG含量升高。GHb是紅細(xì)胞中的血紅蛋白與血清中糖類相互結(jié)合的產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)性且不可逆性糖化反應(yīng)生成[19]，可直接反映血糖濃度，因而可反映患者6～8周血糖控制效果[20]，故在糖尿病診斷中檢測(cè)糖化血紅蛋白含量確診率較高，可有效輔助患者的疾病診斷及治療過(guò)程[21]。在該試驗(yàn)中不同濃度的紅景天提取物灌胃STZ誘導(dǎo)Ⅰ型糖尿病小鼠后，小鼠血糖水平下降，體重有所恢復(fù)，食物利用率升高，血漿中TC、TG、GHb和MDA的活力下降，而SOD活力升高，在一定程度上提高了小鼠的抗氧化能力。

大多數(shù)糖尿病患者缺乏合理進(jìn)食的理念和指導(dǎo)，存在許多飲食和生活誤區(qū)，進(jìn)而加劇病情并伴隨一些嚴(yán)重并發(fā)癥，如機(jī)體心臟、腎臟、肝臟和神經(jīng)等組織器官的慢性病變,功能減退及衰竭,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[22-23]。糖尿病腎病是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，被認(rèn)為是導(dǎo)致終末期腎病的主要誘因，近年來(lái)大約有45%新增的終末期腎病病人是糖尿病腎病患者，目前糖尿病腎病已成為糖尿病患者高死亡率的一個(gè)重要原因[24]。相關(guān)研究表明，紅景天提取物可保護(hù)由對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)肝臟損傷模型小鼠的心肌損傷[25]。結(jié)合該試驗(yàn)結(jié)果，隨著紅景天提取物濃度的提高，肝腎臟器系數(shù)顯著下降，心臟脾臟系數(shù)有所下降，表明紅景天提取物可有效緩解糖尿病小鼠肝腎腫大，對(duì)并發(fā)癥引起的臟器損傷具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，紅景天提取物可通過(guò)降低血漿中的TC、TG、GHb和MDA的含量，提高SOD含量，提高糖尿病小鼠抗氧化能力，緩解小鼠臟器腫大，顯著降低小鼠的血糖，在臨床上常用于降血糖。