安曉麗， 范明智， 李學(xué)峰， 車成來， 廉美蘭， 樸炫春

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

白色紫錐菊(Echinaceapallida(Nutt.)Nutt)為菊科松果菊屬多年生藥用草本植物，株高低于90 cm，花多為淡紫色[1]。原產(chǎn)自北美及加拿大南部等地區(qū)，我國于20世紀(jì)90年代將其作為一種藥用植物進(jìn)行引種，并推廣栽種[2]，目前在我國北京、吉林和云南等地均已成功引種栽培[3]。白色紫錐菊是一種觀賞性較好的花卉植物，也可作為藥用植物長期應(yīng)用于醫(yī)藥等領(lǐng)域。早在300年前，北美印第安人已將其用于治療外傷感染、牙痛、肺結(jié)核以及各種毒蛇昆蟲咬傷等病癥，被當(dāng)?shù)厝朔Q之為“萬靈丹”[4-5]。經(jīng)研究表明，白色紫錐菊含有多種有效活性物質(zhì)，包括多糖類、黃酮類及酚酸類化合物等成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗衰老等功效[6-8]，但在美白方面的研究尚少。

酪氨酸酶，普遍存在于人體及動植物中，又被稱為酚氧化酶或多酚氧化酶[9]。酪氨酸酶作為黑色素形成過程中的主要限速酶，使多巴、多巴醌等產(chǎn)生一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化為黑色素[10]。酪氨酸酶在人體內(nèi)沉積過多會引發(fā)老年斑、色素沉著斑等多種病癥[11]。這些由于色素的異常積攢而造成的皮膚病已嚴(yán)重影響了人們的外在美觀。因此，大多具有美白功效產(chǎn)品的主要成分多為酪氨酸酶抑制劑，其原理主要是通過調(diào)節(jié)酪氨酸酶的活性及其轉(zhuǎn)錄來減少黑色素的合成[12]。植物材料的提取條件對提取物中活性物質(zhì)含量及生物活性具有很大的影響。因此，該試驗(yàn)以生物反應(yīng)器培養(yǎng)的白色紫錐菊不定根為材料，研究了不同條件下提取的不定根提取物對酪氨酸酶活性抑制的影響，旨在篩選出最佳提取工藝，為白色紫錐菊提取物應(yīng)用于美白相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

THC-5B型數(shù)控超聲提取機(jī)(中國濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司)；R201DⅡ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(中國上海申順生物科技有限公司)；YHW-1103遠(yuǎn)紅外鼓風(fēng)干燥箱(中國天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；iMark酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 材料

參考王洪秋等[13]的培養(yǎng)方法擴(kuò)繁白色紫錐菊不定根(圖1)。

圖1 生物反應(yīng)器培養(yǎng)的白色紫錐菊不定根

取白色紫錐菊不定根30 g(鮮重)，接種于含3/4 MS+IBA 1 mg/L+蔗糖 50 g/L的生物反應(yīng)器中，將pH值調(diào)為5.8，在通氣量為0.075 vvm的條件下暗培養(yǎng)30 d。將不定根收獲后，沖洗干凈并進(jìn)行烘干，以備試驗(yàn)所用。

1.3 方法

1.3.1 不同條件提取的不定根提取物對酪氨酸酶活性抑制的影響

參照蔣曉龍等[14]的方法并稍作修改后，進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。稱取不定根干品2 g，浸于80%乙醇中后，在不同提取時間、提取溫度、提取次數(shù)和料液比的條件下，采用超聲法(40 kHz)提取，重復(fù)3次，合并濾液后，減壓濃縮，在45 ℃干燥箱中烘干。將提取時間分別設(shè)為0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h，在溫度為50 ℃，料液比為1∶30(g∶mL)的提取條件下超聲提取3次，進(jìn)行提取時間試驗(yàn)；以提取時間試驗(yàn)中測定的酪氨酸酶活性的抑制率最高的時間作為提取時間，將提取溫度分別設(shè)為25，30，50，70和90 ℃，在料液比為1∶30(g∶mL)的提取條件下，提取3次進(jìn)行提取溫度試驗(yàn)；以試驗(yàn)中測定的酪氨酸酶活性抑制率最高的時間及溫度作為提取條件，將提取次數(shù)分別設(shè)置為1，2，3，4和5次，料液比為1∶30(g∶mL)進(jìn)行提取次數(shù)試驗(yàn)；以試驗(yàn)中測定的酪氨酸酶活性抑制率最高的提取時間、提取溫度、提取次數(shù)為提取條件，將料液比分別設(shè)為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50(g∶mL)進(jìn)行料液比試驗(yàn)。

1.3.2 提取工藝優(yōu)化研究

在以上單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇提取時間、提取溫度、提取次數(shù)及料液比設(shè)定4因素3水平L9(34)正交設(shè)計(jì)(表1)后，按照不同組合的提取條件對不定根進(jìn)行提取，測定不同提取物處理后的酪氨酸酶活性的抑制率，以此作為評價指標(biāo)確定最佳的提取工藝。

表1 L9 (34)的正交試驗(yàn)因素水平

1.4 酪氨酸酶活性抑制率的測定

采用多巴氧化速率法參照蔣曉龍等[14]的方法并稍作修改后測定酪氨酸酶活性。按照表2準(zhǔn)確吸取不定根提取物溶液(1.4 mg/mL)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS, pH值6.8)和1 mmol/L的L-多巴(SIGMA公司，美國)于檢測板中，室溫下孵化10 min后，加入50 U/mL的蘑菇酪氨酸酶(SIGMA公司，美國)溶液，5 min后用酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光值(OD)，計(jì)算酪氨酸酶活性的抑制率。

抑制率/% =[1-(ODA1-ODA2)/(ODA3-ODA4)]× 100%，

式中,ODA1、ODA2、ODA3和ODA4分別為表2中A1、A2、A3和A4反應(yīng)液的OD值。

表2 反應(yīng)液的組成

1.5 數(shù)據(jù)分析

該試驗(yàn)中運(yùn)用SPSS 22.0(Statistical Product and Service Solutions 22.0)對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用鄧肯氏新復(fù)極差法作對比,顯著水平為0.05的每個處理進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件提取的提取物對酪氨酸酶活性抑制的影響

2.1.1 提取時間

在料液比為1∶30，不同的時間(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h)，提取溫度為50 ℃的條件下，重復(fù)3次，并探究不同時間提取的不定根提取物對酪氨酸酶活性抑制的影響。不定根提取物在0.5～2.5 h進(jìn)行提取時，酪氨酸酶活性的抑制率先升高后下降。當(dāng)提取時間為1.5 h時，酪氨酸酶活性的抑制率最高(51.2%)(圖2)。推測隨著提取時間的增加，白色紫錐菊不定根中抑制酪氨酸酶活性的有效物質(zhì)逐漸溶解，但提取時間過長，有些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)會被破壞，使得酪氨酸酶活性的抑制率降低，考慮到提取效率的問題，最適宜的提取時間確定為1.5 h。

圖2 不同時間提取的不定根提取物對酪氨酸酶活性抑制的影響

2.1.2 提取溫度

在料液比為1∶30，提取時間為1.5 h，提取溫度分別為25，30，50，70，90 ℃的條件下，重復(fù)3次，并探究不同溫度下提取的不定根提取物對酪氨酸酶活性抑制的影響。

由圖3可知，當(dāng)提取溫度從25 ℃上升到70 ℃時，酪氨酸酶活性的抑制率呈上升趨勢。當(dāng)提取溫度為70 ℃時，酪氨酸酶活性的抑制率升到最高(53.1%)。說明過低或過高的提取溫度均不利于提取白色紫錐菊不定根中有效成分以及抑制酪氨酸酶的活性，因此，最佳提取溫度選擇70 ℃。

圖3 不同溫度下提取的不定根提取物對酪氨酸酶活性抑制的影響

2.1.3 提取次數(shù)

在料液比為1∶30，提取時間為1.5 h，提取溫度為70 ℃，提取次數(shù)分別為(1，2，3，4，5次)的條件下進(jìn)行提取，并探究不同次數(shù)提取的不定根提取物對酪氨酸酶活性抑制的影響。當(dāng)不定根提取物提取1～3次時，酪氨酸酶活性的抑制率隨著提取次數(shù)的增加而上升。當(dāng)提取3次時，酪氨酸酶活性的抑制率升至54.4%；提取次數(shù)超過3次時，酪氨酸酶活性的抑制率明顯下降(圖4)。因此，選擇最佳提取次數(shù)為3次。

圖4 不同次數(shù)提取的不定根提取物對酪氨酸酶活性抑制的影響

2.1.4 料液比

不同料液比提取的不定根提取物對酪氨酸酶活性抑制的影響列于圖5

圖5 不同料液比提取的不定根提取物對酪氨酸酶活性抑制的影響

在料液比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，提取時間為1.5 h，提取溫度為70 ℃的條件下，重復(fù)提取3次，并探究不同料液比提取的不定根提取物對酪氨酸酶活性抑制的影響。當(dāng)料液比在1∶10～1∶30時，酪氨酸酶活性的抑制率顯著升高；料液比為1∶30和1∶40時，酪氨酸酶活性的抑制率升到最高(55.6%)(圖5)。推測可能隨著料液比的減小，加快了有效成分的溶出，使得白色紫錐菊不定根降低了酪氨酸酶活性；而料液比過低，則不能充分提取出有效成分。因此，確定最佳料液比為1∶30。

2.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)提取工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定L9(34)正交試驗(yàn)方案，對提取時間(A)、提取溫度(B)、提取次數(shù)(C)和料液比(D)4個因素進(jìn)行不同組合，探究了用這些組合提取的提取物對酪氨酸酶活性抑制的影響。正交試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

由表3可知，第7組，即提取時間2 h、提取溫度50 ℃、提取4次、料液比為1∶40時，酪氨酸酶活性抑制率最高(56.1%)。不同提取條件提取的提取物對酪氨酸酶活性抑制的影響不同，對極值R進(jìn)行結(jié)果分析，R值由大到小的順序排列為提取時間(A)> 提取溫度(B)> 料液比(D)> 提取次數(shù)(C)，說明影響最大的是提取時間，然后依次是提取溫度、料液比、提取次數(shù)。分別計(jì)算出各因素水平對酪氨酸酶活性抑制率的平均值K，其中，提取時間(A)和提取次數(shù)(C)中K3值最大，提取溫度(B)和料液比(D)中K2值最大，因此，最優(yōu)條件為A3B2C3D2。

表3 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

進(jìn)一步對不同條件提取的提取物對酪氨酸酶活性的抑制率進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明：提取時間、提取溫度和料液比差異顯著(P<0.05)，但提取次數(shù)無顯著性差異(表4)。因此，從經(jīng)濟(jì)方面考慮，正交試驗(yàn)得到的優(yōu)化組合(A3B2C3D2)中提取次數(shù)可采用1次，優(yōu)化條件為：提取時間2 h、提取溫度70 ℃、提取1次、料液比1∶40。在此條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，并對提取物中酪氨酸酶活性的抑制率進(jìn)行調(diào)查。由表5可知，3次重復(fù)的酪氨酸酶活性抑制率差異不大，平均為57.4%，高于正交試驗(yàn)中第7組(A3B1C1D2,56.1%)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值較小(2.1%)，表明試驗(yàn)結(jié)果具有穩(wěn)定性。因此，白色紫錐菊不定根提取物抑制酪氨酸酶活性的最佳提取條件為：提取時間2 h、提取溫度70 ℃、提取1次、料液比1∶40。

表4 試驗(yàn)方差分析表

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

古往今來，美白一直是廣大女性關(guān)注的熱門話題。目前，大多數(shù)化妝品中所含的氧化劑及防腐劑等多為化學(xué)物質(zhì)，對人體傷害較大。而植物提取物較為安全，并具有顯著的美白、護(hù)膚等功效，因此，植物成分的護(hù)膚品越來越受人們青睞。人體的膚色主要取決于黑色素的含量與分布。因此，在選擇美白類物質(zhì)添加劑時，優(yōu)先考慮能有效抑制酪氨酸酶活性的植物成分。研究發(fā)現(xiàn)，金線蓮叢生芽提取物[15]、貫葉連翹提取物[16]和構(gòu)樹提取物[17]等對酪氨酸酶具有顯著抑制作用，部分植物提取物已應(yīng)用于美白化妝產(chǎn)品中。

同種植物的有效成分在不同提取條件下對酪氨酸酶活性抑制的效果不同，探究提取工藝的不斷優(yōu)化，可達(dá)到更大程度地抑制酪氨酸酶活性的效果。公衍玲等[18]研究了丹參葉總酚酸提取工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最佳提取條件中提取溫度為76 ℃，此時丹參葉總酚酸提取物對酪氨酸酶活性的抑制率最高，這與該試驗(yàn)中篩選的最佳提取溫度70 ℃相似。陳犇等[19]對七子提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明最優(yōu)的提取工藝中提取2 h時，七子白水提取物具有較強(qiáng)抑制酪氨酸酶的作用，而該試驗(yàn)中篩選出的最佳提取時間也為2 h。宋艷玲等[20]研究了獨(dú)角蓮水提物抑制酪氨酸酶活性成分的提取工藝，結(jié)果表明最佳提取條件中的提取1次時，測得的獨(dú)角蓮水提物對酪氨酸酶的抑制率最高，這與本試驗(yàn)中篩選出的提取次數(shù)一致。

4 結(jié)論

對酪氨酸酶活性抑制效果最佳的白色紫錐菊不定根提取工藝為：提取時間2 h、提取溫度70 ℃、提取次數(shù)1次、料液比1∶40(g∶mL)，此時測得的酪氨酸酶活性抑制率57.4%。