尹 娟 胡 彤 徐麗娟 張麗平 葉玉蘭 龐 智1,&

南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 蘇州市立醫(yī)院北區(qū) 消化系疾病與營養(yǎng)研究中心1(215008) 消化內(nèi)科2

背景：克羅恩病(CD)的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，研究表明腸道微生物在其中起重要作用。目的：研究蘇州地區(qū)CD患者糞便真菌菌群結(jié)構(gòu)變化及其與疾病間的關(guān)聯(lián)。方法：納入蘇州地區(qū)初發(fā)CD患者23例和健康對照者18例，采集糞便樣本提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增ITS1片段構(gòu)建克隆文庫，HiSeq平臺測序，基于OTU行樣本物種多樣性分析和組間物種差異分析，并進(jìn)一步分析在CD患者中豐度上調(diào)的真菌與炎性指標(biāo)CRP、ESR、糞便鈣衛(wèi)蛋白和CD活動(dòng)指數(shù)(CDAI)的相關(guān)性。結(jié)果：CD患者糞便樣本中的真菌物種多樣性顯著小于健康人。從門、綱、目、科、屬、種各水平分析，CD患者糞便中豐度顯著上調(diào)的真菌為酵母綱(Saccharomycetes)、酵母目(Saccharomycetales)、位置未定科(Incertae_sedis)、念珠菌屬(Candida)、白念珠菌(Candida albicans)，新增真菌為絲孢酵母目(Trichosporonales)、絲孢酵母科(Trichosporonaceae)，豐度顯著下調(diào)的真菌為節(jié)擔(dān)菌綱(Wallemiomycetes)，缺失真菌為球囊菌門(Glomeromycota)、球囊菌綱(Glomeromycetes)、球囊霉科(Glomeraceae)、路德酵母屬(Lodderomyces)、中間念珠菌(Candida intermedia)、念珠菌(Candida sp)。CD患者糞便白念珠菌豐度與糞便鈣衛(wèi)蛋白呈顯著正相關(guān)(r=0.557,P=0.031)。結(jié)論：CD患者腸道真菌菌群與健康人相比發(fā)生顯著結(jié)構(gòu)變化，真菌物種多樣性減小，條件致病真菌如白念珠菌豐度增加，可能參與了疾病進(jìn)程。

克羅恩病(Crohn’s disease,CD)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的常見類型之一，其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。既往研究表明，腸道微生物(包括細(xì)菌、真菌和病毒)在IBD發(fā)病中起重要作用[1-9]。隨著16S宏基因組測序的二代測序技術(shù)在腸道微生態(tài)研究中的普遍應(yīng)用，近年對IBD腸道菌群的研究日益深入。因真菌培養(yǎng)和針對真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)測序存在技術(shù)難點(diǎn)以及數(shù)據(jù)庫不完善，目前國、內(nèi)外分析CD患者腸道真菌菌群譜的研究報(bào)道較少[8]。且因地域、采樣和研究方法不同，不同研究間結(jié)果存在較大差異[9]。Ott等[10]和Li等[11]的研究表明CD患者腸黏膜組織和糞便樣本中的真菌多樣性增加，Hoarau等[12]發(fā)現(xiàn)CD患者糞便樣本中的真菌多樣性降低，Sokol等[13]和Liguori等[14]分別對CD患者的糞便樣本和腸黏膜組織進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其真菌多樣性與健康對照者相比無明顯變化?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中，CD患者存在豐度差異的真菌種類也不盡一致，如在糞便樣本中，Li等[11]發(fā)現(xiàn)白念珠菌(C.albicans)、新型隱球菌(C.neoformans)增加，Hoarau等[12]等發(fā)現(xiàn)熱帶念珠菌(C.tropicalis)增加，Sokol等[13]發(fā)現(xiàn)白念珠菌增加、釀酒酵母(S.cerevisiae)減少。為此，本研究收集江蘇省蘇州地區(qū)初發(fā)CD患者的糞便樣本行ITS1測序分析，探討該地區(qū)CD患者真菌菌群結(jié)構(gòu)變化及其與疾病間的關(guān)聯(lián)。

材料與方法

一、臨床樣本采集

2018年5月—2019年8月蘇州市立醫(yī)院北區(qū)消化內(nèi)科初發(fā)CD患者23例和健康體檢者18例納入研究。入選者均無慢性疾病，就診前1個(gè)月內(nèi)無用藥記錄。CD患者診斷符合我國IBD診治共識，剔除急性腸炎和腸易激綜合征。于排便后1 h內(nèi)采集糞便樣本5 g，按0.2 g/份進(jìn)行分裝，過液氮后-80 ℃冰箱保存。研究方案經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)[南醫(yī)大倫審(2017)277號]，并取得所有受檢者的知情同意。

二、真菌特異性ITS1區(qū)克隆文庫構(gòu)建和測序分析

使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(QIAGEN)抽提糞便樣本基因組DNA，取質(zhì)量合格的樣品30 ng和ITS1區(qū)對應(yīng)的融合引物配置PCR反應(yīng)體系，設(shè)置反應(yīng)參數(shù)，行PCR擴(kuò)增。使用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒(Beckman Coulter)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于洗脫緩沖液中，貼上標(biāo)簽，完成建庫。使用生物芯片分析系統(tǒng)(Agilent 2100 Bioanalyzer)檢測文庫片段范圍和濃度，經(jīng)檢測合格的文庫根據(jù)插入片段大小，選擇HiSeq測序平臺進(jìn)行測序。本步驟中的糞便樣本基因組DNA提取和HiSeq測序由武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司完成。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.多樣性分析：使用Mothur軟件分析樣品alpha多樣性。

2.聚類分析：使用phytools軟件和R語言(v3.5.1)，根據(jù)Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離矩陣做UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean)聚類分析。對OTU(operational taxonomic unit)進(jìn)行物種分類，使用R語言(v3.5.1)在種水平對各樣品作物種豐度柱狀圖(豐度在所有樣品中均低于0.5%的物種合并為others)。將聚類結(jié)果與各樣品物種相對豐度整合，直觀展示樣品的物種組成及其差異情況。

3.差異分析：使用R語言(v3.1.1)Venn-Diagram包繪制OTU Venn圖；使用R語言(v3.2.1)mixOmics包繪制OTU PLS-DA(partial least squares discrimination analysis)圖；使用R語言(v3.4.1)繪制兩組Top 10豐度OTU差異比較柱狀圖；使用R語言(v3.4.1)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，分析組間物種豐度差異，計(jì)算P值和FDA(false discovery rate)值。

4.相關(guān)性分析：使用GraphPad Prism軟件分析CD組豐度差異真菌白念珠菌的測序豐度與C反應(yīng)蛋白(CRP)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、糞便鈣衛(wèi)蛋白(calprotectin,CALP)和CD活動(dòng)指數(shù)(CDAI)之間的相關(guān)性。

結(jié) 果

一、一般資料

蘇州地區(qū)23例初發(fā)CD患者的CDAI均值為175.2，兩組受檢者具體臨床信息見表1。

表1 CD患者和健康對照者臨床信息

二、CD患者糞便樣本中真菌物種多樣性(species diversity)小于健康對照者

對23例初發(fā)CD患者和18例健康對照者糞便樣本基因組DNA真菌特異性ITS1區(qū)進(jìn)行建庫測序，質(zhì)控OTU累積曲線末端上升趨勢趨于平緩，表明采樣量足夠，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)具有代表性。對兩組中能與OTU代表序列比對且OTU具有注釋結(jié)果的tags總數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示CD組tags總數(shù)(真菌總量)均值高于健康對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(41 103對33 382,P=0.151 4)。

分析兩組單個(gè)樣品中的物種多樣性，shannon指數(shù)(P=0.004 7)和simpson指數(shù)(P=0.004 3)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明CD組糞便樣本中的真菌物種多樣性顯著小于健康對照組；兩組Good coverage值均接近1，表明樣品中序列未被測出的概率低(圖1、表2)。

由下至上5條線分別為最小值、下四分位數(shù)、中位數(shù)、上四分位數(shù)和最大值，異常值以“?”表示圖1 CD患者和健康對照者糞便樣本單個(gè)樣品真菌物種多樣性分析(alpha多樣性箱型圖)

表2 CD患者和健康對照者糞便樣本真菌物種多樣性alpha多樣性指數(shù)比較

對糞便樣本真菌種水平的UPGMA聚類分析和豐度分析直觀展示了所有測序樣品的真菌物種組成及其差異情況，結(jié)果同樣表明CD組真菌物種多樣性更低，且在聚類圖中部有聚集(圖2)。

左圖為UPGMA聚類樹結(jié)果，右圖為物種豐度柱狀圖樣品越靠近，枝長越短，表明兩個(gè)樣品的物種組成越相似圖2 UPGMA聚類樹與豐度組合圖

三、CD患者糞便樣本差異真菌分析

OTU Venn圖結(jié)果顯示CD組糞便樣本中真菌OTU數(shù)目小于健康對照組(122對149)，共有OTU數(shù)為57個(gè)。OTU PLS-DA分析結(jié)果表明根據(jù)OTU豐度差異可將CD患者和健康對照者區(qū)分為兩群(圖3A)。Top10豐度OTU差異比較柱狀圖表明兩組豐度前10的OTU中有兩個(gè)(OTU15和OTU177)存在顯著差異(圖3B)，種水平上分別可注釋到似平滑念珠菌(C.metapsilosis)和白念珠菌。種水平的物種豐度差異分析發(fā)現(xiàn)CD組白念珠菌顯著增多，中間念珠菌(C.intermedia)缺失(圖4)。

A：OTU PLS-DA圖(橫、縱坐標(biāo)軸刻度為相對距離，無實(shí)際意義)；B：Top10豐度OTU差異比較柱狀圖(*兩組間比較，P<0.05)圖3 CD患者和健康對照者OTU PLS-DA圖和Top10豐度OTU差異比較柱狀圖

左圖為兩組物種相對豐度柱狀圖；中間為同一物種在兩組中平均相對豐度比值(健康對照/CD)的log2值；右圖為Wilcoxon秩和檢驗(yàn)P值和FDR值圖4 CD患者和健康對照者糞便樣本真菌物種豐度差異Wilcox秩和檢驗(yàn)結(jié)果

從門、綱、目、科、屬、種水平綜合分析兩組間測序豐度存在顯著差異的真菌，CD組糞便樣本中豐度顯著上調(diào)的真菌為酵母綱(Saccharomycetes)、酵母目(Saccharomycetales)、位置未定科(Incertae_sedis)、念珠菌屬(Candida)、白念珠菌，新增真菌為絲孢酵母目(Trichosporonales)、絲孢酵母科(Trichosporonaceae)，豐度顯著下調(diào)的真菌為節(jié)擔(dān)菌綱(Wallemiomycetes)，缺失真菌為球囊菌門(Glo-meromycota)、球囊菌綱(Glomeromycetes)、球囊霉科(Glomeraceae)、路德酵母屬(Lodderomyces)、中間念珠菌、念珠菌(Candidasp)(表3)。

表3 CD患者糞便樣本豐度差異真菌

四、CD患者糞便樣本白念珠菌豐度與CALP呈正相關(guān)

相關(guān)性分析顯示，CD患者糞便樣本中豐度顯著上調(diào)的白念珠菌與CRP、ESR、CDAI無明顯相關(guān)性，與糞便CALP呈顯著正相關(guān)(r=0.557 0,P=0.031 0；圖5)。

圖5 CD患者糞便樣本白念珠菌豐度與CRP、ESR、糞便CALP和CDAI的相關(guān)性分析

討 論

人體內(nèi)的真菌菌群紊亂與平衡呈動(dòng)態(tài)過程，是塑造機(jī)體免疫應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[15]。共生真菌如白念珠菌、釀酒酵母等可能在馴化宿主免疫系統(tǒng)，從而更有效地對抗病原微生物方面起重要作用[16]。CD和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是IBD最常見的兩種類型，且發(fā)病機(jī)制不明。目前國、內(nèi)外越來越多的研究證據(jù)表明真菌在IBD中起有免疫調(diào)節(jié)作用，人體免疫系統(tǒng)與真菌之間相互作用的改變可能參與了IBD的發(fā)病過程。Dectin-1和CARD9分別為真菌β-葡聚糖受體和抗真菌受體的下游基因[15]。Iliev等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，C型凝集素受體Dectin-1缺失可使小鼠對共生真菌的免疫應(yīng)答發(fā)生改變，從而對化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎易感；UC患者的Dectin-1基因多態(tài)性與疾病嚴(yán)重程度顯著相關(guān)。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)CARD9 與IBD易感性相關(guān)[18-19]。早年研究[20]也發(fā)現(xiàn)血清抗釀酒酵母抗體可作為CD診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。因此，研究CD患者腸道真菌豐度改變及其與免疫系統(tǒng)的關(guān)系，對于探討CD發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)蘇州地區(qū)初發(fā)CD患者糞便樣本中的真菌菌群結(jié)構(gòu)與健康對照者相比有顯著差異，真菌總量略有升高，但與健康對照者間差異不顯著；CD患者糞便真菌物種多樣性減小，在門、綱、目、科、屬、種各水平均與健康對照者存在顯著差異。分析顯示CD患者糞便樣本中白念珠菌豐度顯著增加，與國外多數(shù)研究結(jié)果一致[11,13]。白念珠菌作為腸道共生真菌，在誘導(dǎo)免疫耐受中發(fā)揮重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)是維持機(jī)體對黏膜部位抗原的抗炎與促炎免疫反應(yīng)平衡的核心?；顒?dòng)期CD患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例低于非活動(dòng)期CD患者，存在機(jī)體免疫抑制功能失調(diào)[21]。有研究[22]發(fā)現(xiàn)健康人外周血中含有大量針對共生白念珠菌的抗原特異性Treg細(xì)胞。據(jù)此推測，CD患者腸道中白念珠菌豐度增加，可能導(dǎo)致外周血白念珠菌特異性Treg細(xì)胞增加，抑制腸黏膜對白念珠菌的免疫反應(yīng)。此種抑制作用可能使共生白念珠菌有機(jī)會在腸道內(nèi)進(jìn)一步增殖，打破腸道真菌菌群結(jié)構(gòu)平衡，使真菌物種多樣性降低。繼而在CD后期，白念珠菌可能作為條件致病真菌引發(fā)真菌感染。目前IBD疾病本身和(或)治療藥物相關(guān)真菌感染已成為臨床醫(yī)師關(guān)注的熱點(diǎn)問題[23]。此外，還需結(jié)合CD患者的基因多態(tài)性情況進(jìn)行推測?；颊叩恼婢庖呦嚓P(guān)基因如Dectin-1、CARD9等的多態(tài)性或突變可致真菌與宿主間的免疫作用異常，使人體不能抑制白念珠菌等條件致病真菌增殖及其誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。

近期國、內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在IBD發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用[24-26]。活動(dòng)期CD和UC患者腸黏膜組織和外周血CD177+中性粒細(xì)胞比例顯著高于健康對照者；與CD177-中性粒細(xì)胞相比，CD177+中性粒細(xì)胞分泌較低水平的促炎細(xì)胞因子如干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-17A，同時(shí)分泌較高水平的IL-22和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，抗菌活性增強(qiáng)[24-25]。中性粒細(xì)胞是抵抗真菌感染最主要的固有免疫效應(yīng)細(xì)胞，其抗真菌機(jī)制主要包括吞噬真菌、通過呼吸爆發(fā)產(chǎn)生活性氧、釋放抗菌顆粒以及形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps)[27]。中性粒細(xì)胞分泌的CALP亦有抗微生物感染作用。條件致病真菌白念珠菌的菌絲形態(tài)與其侵襲組織和引發(fā)感染的致病潛能相關(guān)，此種菌絲形態(tài)可觸發(fā)中性粒細(xì)胞的遷移活性，進(jìn)而殺傷白念珠菌[28]。本研究進(jìn)一步分析了白念珠菌與CD患者中性粒細(xì)胞之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)患者糞便樣本中的CALP濃度與白念珠菌豐度呈顯著正相關(guān)。由此推測白念珠菌在CD中可能起促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)的作用，如促進(jìn)CALP分泌。本研究未發(fā)現(xiàn)白念珠菌豐度與炎性指標(biāo)ESR、CRP和反映病情嚴(yán)重程度的CDAI之間存在相關(guān)性，可能與樣本量較小有關(guān)。

綜上所述，本研究分析了蘇州地區(qū)初發(fā)CD患者的糞便真菌菌群結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)患者腸道真菌菌群與健康人相比發(fā)生顯著結(jié)構(gòu)變化，真菌生物多樣性減小，條件致病真菌如白念珠菌豐度增加，可能參與了疾病進(jìn)程。研究具有一定地域特色，可為CD臨床診療以及相關(guān)機(jī)制研究提供參考數(shù)據(jù)。本研究的局限性主要包括：樣本量偏小，可能因采樣因素造成統(tǒng)計(jì)誤差；未設(shè)置UC對照組，未能明確特定真菌豐度變化是否為CD特異性。此外，腸道微生態(tài)中的細(xì)菌與真菌之間存在相互影響，如能對糞便樣本同時(shí)進(jìn)行16S測序，對分析細(xì)菌與真菌在CD中的相互作用具有重要意義。因此，本課題組后續(xù)擬擴(kuò)大CD患者糞便樣本量，同時(shí)收集UC、普通腸炎和腸易激綜合征患者的糞便樣本，同時(shí)行ITS和16S測序，從而更深入地研究CD患者腸道真菌菌群在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用。