王琦 謝曉佩 吳慶俠

摘要：益生枯草芽孢桿菌可以替代部分抗生素，安全無污染，在臨床上具備治療、預防細菌性腸道疾病的功效。為研究牦牛源枯草芽孢桿菌對大腸埃希氏菌是否具有益生作用，試驗采用體外抑菌試驗、藥敏試驗、大腸埃希氏菌攻毒和制作石蠟切片觀察腸道組織變化的方法，探究其益生作用。結(jié)果表明，在4株牦牛源枯草芽孢桿菌中，Yak-KC7的抑菌效果最佳，抑菌直徑達到（25±1） mm;其次是Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6，抑菌直徑分別達到（17±1）、（22±2）、（20±2） mm。從病理切片得出，試驗組腸道組織較對照組大幅改善。因此，該菌具有治療大腸埃希氏菌疾病的作用，有作為益生菌株的潛能，為西藏地區(qū)益生菌種提供了參考。

關(guān)鍵詞：牦牛源枯草芽孢桿菌;益生作用;大腸埃希氏菌;治療;切片

中圖分類號： S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0157-09

收稿日期：2019-07-02

基金項目：西藏自治區(qū)重點研發(fā)及轉(zhuǎn)化計劃（編號：XZ201902NB05）;西藏自治區(qū)科技重大專項（編號：XZ201901NA02）;國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（編號：CARS-37）。

作者簡介：王 琦（1997—），女，山東泰安人，從事動物醫(yī)學研究。E-mail：1154101489@qq.com。

通信作者：吳慶俠，博士，副教授，研究方向為動物疾病病理研究。E-mail：goodwqx@163.com。 ?在集約化、規(guī)?；膭游锷a(chǎn)模式下，畜禽舍諸多應激因子富集，致使動物機體免疫力下降，發(fā)病率大幅提高。我國從20世紀80年代開始使用抗生素，以此來預防、治療細菌感染，促進動物生長[1]。長期以來，應用抗生素治療細菌性疾病的方法雖對畜禽疾病有顯著成果，但隨著抗生素的普及甚至濫用，卻給社會帶來了藥物殘留、病菌產(chǎn)生耐藥性、環(huán)境污染等多種問題，直接危害人類健康[2]。嚴格控制抗生素的使用，杜絕其濫用已成為各國的共識。因此，尋求無污染、無毒副作用、無藥物殘留、效果好的微生態(tài)制劑已成為研究的熱點[3-4]?？股氐奶娲酚卸喾N，而在眾多替代品中，益生菌作為一種無毒、無害、無藥物殘留、無耐藥性的微生態(tài)制劑，有利于平衡腸道內(nèi)的菌群，可治療、預防細菌性疾病，已成為動物疾病防治的新選擇[5]。

長期以來，腹瀉一直是困擾動物行業(yè)的一個重要問題，大量甚至過量使用抗生素，雖然能在短期內(nèi)奏效，但缺乏長期可持續(xù)效果[6]。由于抗生素的普遍使用，致使外界環(huán)境和動物體內(nèi)的細菌對現(xiàn)在所使用的抗生素都表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，因此尋求一種新的安全有效、無污染的抗生素替代物對動物行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要[6]。與此同時，西藏牦牛多發(fā)春季腹瀉，現(xiàn)階段開發(fā)的枯草芽孢桿菌制品并不能完全科學高效地適應西藏牧區(qū)的需要，因此篩選出安全、科學、有效的適宜高原動物使用的具有益生性能的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）至關(guān)重要。

1 試驗材料

1.1 菌株

耐腸液耐膽鹽的牦牛源枯草芽孢桿菌4株（Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7），均由西藏農(nóng)牧學院獸醫(yī)臨床重點實驗室分離保存。

大腸埃希氏菌（血清型O111），由西藏農(nóng)牧學院獸醫(yī)臨床重點實驗室提供;金黃色葡萄球菌（ATCC29213），由南京合益生物技術(shù)有限公司供給。

1.2 試驗動物

4只健康家兔購自林芝某農(nóng)貿(mào)市場。

1.3 主要試劑及試劑盒

藥敏紙片、營養(yǎng)瓊脂（NA）、枯草芽孢桿菌選擇培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂、營養(yǎng)肉湯（NB）、麥康凱瓊脂均購自杭州濱和微生物試劑設備有限公司;95%乙醇、切片石蠟、二甲苯均購自成都市聯(lián)合化工試劑研究所;蘇木精染色液（A液）、伊紅染液（醇溶型）（B液）、分化液（C液）、返藍液（D液）、10%福爾馬林中性固定液均購自南昌雨露實驗設備有限公司。

1.4 主要儀器

LRH-150生化培養(yǎng)箱、干熱消毒箱均購自上海森信實驗儀器有限公司;Jan-90磁力攪拌器、電子天平、HH S-2數(shù)顯恒溫水浴鍋、HNY-2112B恒溫振蕩器均購自金壇市盛藍儀器制造有限公司;臺式高速離心機購自長沙湘鷹離心機有限公司;TDZ4-WS臺式低速離心機購自湖南湘儀離心機儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司;QP-3168轉(zhuǎn)輪式石蠟切片機、TEC-2800病理組織包埋冷凍臺、TEC-2800組織包埋機均購自常州市郝思林醫(yī)用儀器有限公司;超凈工作臺購自蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司。

2 試驗方法

2.1 菌液復蘇

取于-80 ℃冰箱保存的枯草芽孢桿菌Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7的菌液各 1 mL，將其接種于B.subtilis選擇培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將菌復蘇，然后用接種環(huán)選取單個菌落，接種于100 mL NB培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)12 h，以增強細菌活力[7]。

2.2 牦牛源枯草芽孢桿菌的抑菌試驗

對復蘇的4株牦牛源枯草芽孢桿菌的12 h培養(yǎng)物3 500 r/min離心5 min。將指示菌大腸埃希菌（血清型O111）、金黃色葡萄球菌（ATCC29213）復蘇，指示菌菌液濃度稀釋至10萬 CFU/mL。分別取已稀釋好的大腸埃希氏菌（血清型O111）菌液 0.4 mL 和金黃色葡萄球菌菌液0.4 mL，用滅菌的三角環(huán)均勻涂布在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基上，用鑷子取出已被滅菌的牛津杯，輕輕放在已涂布過大腸桿菌O111菌液的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基和涂布過金黃色葡萄球菌菌液的NA培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基上放4只牛津杯，注意4只牛津杯的分布位置要均勻。然后將其放入4 ℃冰箱中，30 min后取出。分別吸取 0.25 mL 離心后的Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7的上清液，然后分別注入4個牛津杯中[8]，先將其放入4 ℃冰箱擴散24 h，然后接著將其放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察有無抑菌圈產(chǎn)生，用游標卡尺精準測量抑菌圈直徑[9]。該試驗操作3次，取平均值。

2.3 牦牛源枯草芽孢桿菌的藥敏試驗

采用K-B紙片擴散法，根據(jù)抑菌圈直徑判斷分離的菌株對于常見的抗菌藥物是否敏感[10]。

復蘇菌液：用接種環(huán)挑取單個菌落接種于NB培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)12 h，進行增菌。取0.4 mL已稀釋好的枯草芽孢桿菌菌液，用滅菌的三角環(huán)均勻涂布在枯草芽孢桿菌選擇培養(yǎng)基上，待菌液干后，用滅菌鑷子取藥敏紙片均勻貼于培養(yǎng)基表面。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。24 h后將其拿出，用游標卡尺精準測量抑菌圈直徑[11]。該試驗操作3次，取平均值。

2.4 牦牛源枯草芽孢桿菌對被大腸埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔的治療作用研究

2.4.1 動物試驗設計 在林芝農(nóng)貿(mào)市場購買4只狀態(tài)良好的家兔，經(jīng)臨床檢查4只家兔均健康。將家兔隨機分為2組。4只健康家兔分別編號為1#、2#、3#、4#。1#、2#為對照組，3#、4#為試驗組。試驗過程中，2組兔單獨飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境保持通風，飼料、飲水保證充足，衛(wèi)生狀況條件良好。飼喂周期為14 d。

試驗進行到15 d時，將大腸埃希氏菌（血清型O111）經(jīng)37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)12 h后離心，收集菌體，將菌液調(diào)整到攻毒濃度[12]，對4只家兔采用腹腔注射的方法注射大腸埃希氏菌（血清型O111）。每日注射濃度為10億CFU/mL的大腸埃希氏菌（血清型O111），5 mL/只，1次/d，連續(xù)注射4 d。4只家兔均腹瀉，腹瀉率為100%。對照組2只家兔不作處理，使其自然止瀉，其中1只死亡，死亡率為50%。給試驗組2只家兔灌服牦牛源枯草芽孢桿菌菌液，灌服劑量均為20 mL/只，1次/d，連續(xù)給藥7 d，每日觀察家兔腹瀉情況以及對照組和試驗組家兔止瀉情況，并記錄[13]。

2.4.2 腸道病理組織觀察 連續(xù)給藥7 d后給兔耳靜脈注射空氣，將3只（共4只家兔，其中1只死于腹瀉）家兔處死，取材，制作石蠟切片。取材時打開腹腔，將整個消化管取出，觀察是否有出血斑、出血點等病變現(xiàn)象，找到健康組織與病變組織的交界處，10 min內(nèi)分段取材，分別取十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸各1 cm3，然后用10%中性福爾馬林固定液固定。制作石蠟切片時將病變組織切成5 mm大小，制作成石蠟切片（厚度為 6 μm），最后用蘇木素-伊紅染色，用光學顯微鏡觀察組織病理變化情況。石蠟切片制作過程參照《家畜組織學與胚胎學實驗指導》完成，并做部分修改[14]。

3 結(jié)果與分析

對4株枯草芽孢桿菌進行了大腸埃希氏菌（血清型O111）、金黃色葡萄球菌的抑菌試驗。4個菌株對大腸埃希氏菌（血清型O111）和金黃色葡萄球菌都具有抑菌作用，但抑菌效果不同。其中，Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6對致病菌的抑制能力較強，Yak-KC7對致病菌的抑制能力最佳。

3.1 抑菌試驗結(jié)果

4株牦牛源枯草芽孢桿菌對大腸埃希氏菌（血清型O111）和金黃色葡萄球菌都具有抑菌作用，但抑菌效果不同[15]。對金黃色葡萄球菌，Yak-KC7的抑菌效果最佳，抑菌直徑最大，達到26 mm;其次是Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6，抑菌直徑分別達到（16±1）、（20±2）、（20±1） mm。對大腸埃希氏菌（血清型O111），Yak-KC7的抑菌效果最佳，抑菌直徑達到（25±1） mm;其次是Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6，抑菌直徑分別達到（17±1）、（22±2）、（20±2） mm。抑菌圈直徑詳見表1和圖1至圖9。

3.2 藥敏試驗結(jié)果

采用K-B紙片擴散法，選取20種常用藥物做試驗，Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7對于鏈霉素具有中度敏感性，說明4個株菌對鏈霉素有一定的耐受性;而對于絕大多數(shù)的藥物敏感，不具有耐受性。試驗結(jié)果表明，Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7均無耐藥性，無攜帶耐藥基因的風險。在使用益生枯草芽孢桿菌時，不應與其敏感的抗生素一起使用，這是保證益生菌發(fā)揮作用的關(guān)鍵[16]，這樣既可提高動物的抵抗力，又可增強微生態(tài)制劑的應用效果。藥物敏感試驗結(jié)果詳見表2。藥敏試驗抑菌圈直徑見圖10至圖12。

3.3 牦牛源枯草芽孢桿菌對被大腸埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔的治療作用

用篩選出的益生性能最佳的枯草芽孢桿菌 Yak-KC7，探究其對被大腸埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔的治療作用。

攻毒對照組2只家兔腹瀉率為100%，自然止瀉，不作任何處理，死亡率為50%，死亡前，精神狀態(tài)不佳，喜臥，被毛粗亂無光澤;死亡后，糞便有特殊氣味，惡臭，呈稀糊狀，顏色為黃綠色。家兔肛門尾部及其周圍附有黏糞，詳見圖13。試驗組腹瀉率100%，死亡率0%。給藥7 d后，觀察腹瀉情況，實驗組家兔經(jīng)Yak-KC7的治療，劑量20 mL/頭，1次/d，共給藥7 d，無死亡，詳見圖14。制作石蠟切片觀察腸道組織變化，結(jié)果表明牦牛源枯草芽孢桿菌對被大腸埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔具有明顯的治療作用，詳見圖15至圖38。

由病理組織切片可觀察到，對照組十二指腸腸壁絨毛逐漸開始溶解，絨毛變短且排列稀疏;試驗組十二指腸絨毛排列緊密并增長，似圓指狀。對照組空腸絨毛與腸壁分離，絨毛上段斷裂，細胞排列混亂;試驗組空腸絨毛斷裂減輕，腸壁與腸絨毛未分離，細胞間連接正常。對照組回腸腸壁絨毛與腸壁分離，絨毛中段破碎嚴重，細胞間的連接結(jié)構(gòu)發(fā)生變形;試驗組回腸絨毛破碎減輕，未出現(xiàn)絨毛與腸壁分離現(xiàn)象。對照組盲腸部分腸壁絨毛斷裂;試驗組盲腸破壞程度大大減輕。對照組結(jié)腸絨毛嚴重破碎，細胞排列混亂、混淆不清，絨毛與腸壁開始

分離;試驗組結(jié)腸絨毛破碎減輕。對照組直腸與試驗組直腸無顯著性差異。

綜上， 試驗組腸道病理變化較對照組腸道病理變化均大幅改善。對照組腸道損傷較大，刷狀緣損傷，微絨毛萎縮，上皮細胞排列紊亂。具體表現(xiàn)為

腸黏膜水腫、萎縮、壞死，細胞排列混亂，腸壁脫落明顯，細胞間的連接結(jié)構(gòu)扭曲。結(jié)構(gòu)變化導致功能受損， 導致動物嚴重腹瀉。試驗組經(jīng)牦牛源枯草芽

孢桿菌Yak-KC7治療，絨毛水腫現(xiàn)象、黏膜病理變化顯著改善，絨毛高度明顯增加，排列更緊湊整齊，上皮細胞無脫落現(xiàn)象[17-21]。

4 討論

益生枯草芽孢桿菌作為一種生物拮抗劑，有利

于平衡腸道菌群，還能夠治療、預防細菌性疾病[22]。且由于能夠產(chǎn)生芽孢，在長期儲存甚至惡劣環(huán)境中仍可以保證活菌數(shù)，因此成為了益生菌的熱選方向

之一[23]。本試驗便是通過給被大腸埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔灌服牦牛源枯草芽孢桿菌 Yak-KC7，探究其對家兔腸道組織是否具有益生作用。

郭夢嬌在研究中指出，盡管許多科研結(jié)果表明B.subtilis具有益生菌的潛力和功能，但B.subtilis至今在市場上沒有得到很好的應用。研究表明，主要原因是沒有性能足夠優(yōu)良的菌種用于實際生產(chǎn)[21]。

4.1 抑菌試驗

研究證明，大多數(shù)芽孢桿菌對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性有致病能力的菌都有抑制作用[23]，對金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等都有抑制能力。而本試驗僅證明了Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7對大腸埃希氏菌（血清型O111）、金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強的抑制能力，因此后續(xù)還應對更多菌種進行抑菌試驗。

4.2 藥敏試驗

至關(guān)重要的是，益生菌須滿足不具有耐藥性這一特性，以確保食用安全性。試驗結(jié)果表明，牦牛源枯草芽孢桿菌不具有耐藥性，不存在攜帶或轉(zhuǎn)移耐藥基因的風險。研究表明，在使用益生枯草芽孢桿菌時，不應與其敏感的抗生素一起使用，這是保證益生菌起作用的關(guān)鍵。

4.3 牦牛源枯草芽孢桿菌對被大腸埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔的治療作用

動物性試驗的牦牛源枯草芽孢桿菌使用劑量是根據(jù)枯草芽孢桿菌對大腸桿菌O111攻毒的家兔治療使用劑量的試驗而定。治療劑量為20 mL/頭，1次/d，持續(xù)給藥7 d。關(guān)于牦牛源枯草芽孢桿菌對被大腸埃希氏菌（血清型O111）攻毒家兔細菌性腹瀉的治療作用，筆者僅進行了每天給藥1次的治療試驗，而沒有做每天給藥2次和3次的試驗，每天給藥2次和3次的治療率將大于每天給藥1次的治療率。綜上，牦牛源枯草芽孢桿菌具有治療被大腸埃希氏菌感染的細菌性腸道疾病的作用。試驗期間未發(fā)現(xiàn)不良反應。

由組織石蠟切片可看出，大腸埃希氏菌對動物腸道造成了不同程度的破壞，回腸和結(jié)腸組織破壞程度最嚴重，十二指腸、空腸、盲腸次之，直腸變化不明顯。該試驗攻毒是采用腹腔注射的方法，若采用灌服的方法，組織變化是否會有所不同，還需進一步研究探討。

試驗組家兔腸道病理變化較對照組腸道病理變化均大幅改善。對照組腸道破壞程度較大，微絨毛萎縮，刷狀緣損傷，上皮細胞排列混亂。具體表現(xiàn)為腸黏膜水腫、萎縮，嚴重的甚至壞死，細胞排列紊亂，腸壁脫落明顯，細胞間的連接結(jié)構(gòu)變形。試驗組經(jīng)牦牛源枯草芽孢桿菌Yak-KC7治療，絨毛水腫現(xiàn)象、黏膜病理變化明顯減輕，絨毛高度明顯增加，排列更緊湊整齊，上皮細胞無脫落現(xiàn)象。

5 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，4株牦牛源枯草芽孢桿菌Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7對大腸埃希氏菌（血清型O111）、金黃色葡萄球菌均有良好的抑制作用，Yak-KC7對大腸埃希氏菌（血清型O111）、金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳。動物性試驗證明，牦牛源枯草芽孢桿菌對被大腸埃希氏菌（血清型O111）感染的家兔腸道有良好的治療效果，且該菌安全無毒，不具有耐藥性。綜上，牦牛源枯草芽孢桿菌具有益生作用，有作為益生菌株的潛能，為西藏地區(qū)益生菌種提供了參考。

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