胡榮鎖 甘小紅 董文江 龍宇宙 宗迎 初眾

摘? 要：為探究不同外源添加物對咖啡果皮酒風味和感官品質的影響，本研究添加4種可發(fā)酵糖（葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖）和2種可發(fā)酵氨基酸（精氨酸和谷氨酸）發(fā)酵生產(chǎn)咖啡果皮酒。以頂空固相微萃取-氣相質譜法結合感官評價，分析外源添加物對咖啡果皮酒風味和感官品質的影響。結果表明：共檢出9大類75種風味組分，以酯類和醇類為主;添加可發(fā)酵糖能顯著增加咖啡果皮酒醇類組分（23.99%～121.24%），添加可發(fā)酵氨基酸咖啡果皮酒能增加酯類組分（25.77%～28.18%），而添加可發(fā)酵糖咖啡果皮酒酯類組分顯著減少（10.81%～69.94%）;方差齊性檢驗P=0.206>0.05，在α=0.05的水平上各外源添加物果酒風味組分沒有顯著性差異，事后兩兩比較P=（0.371～0.989）>0.05，說明樣品間差異不顯著，但PCA分析（PC1：96.01%，PC2：3.13%）能將其完全區(qū)分;使用模糊數(shù)學法感官評判發(fā)現(xiàn)，添加精氨酸所釀造的果酒綜合得分最高（92.40），更加適合人們的口味，整體風格顯著，協(xié)調性好，谷氨酸添加次之（80.80），果糖和蔗糖所釀造的咖啡果皮酒綜合評分一致（78.20），添加麥芽糖果酒得分最低（74.20）。綜上所述，添加氨基酸可改善咖啡果皮酒風味和口感，發(fā)酵糖改善效果不如氨基酸。

關鍵詞：外源添加物;咖啡果皮酒;風味;感官品質中圖分類號：TS262 ?????文獻標識碼：A

Influence of Different Exogenous Fermentable Sugars and AminoAcids on Flavor and Sensory Quality of Coffee Pulp Wine

HU Rongsuo^{1，3，4}， GAN Xiaohong²， DONG Wenjiang^{1，3，4}， LONG Yuzhou^{1，3，4*}， ZONG Ying^{1，3，4}， CHU Zhong^{1，3，4}

1. Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan 571533， China; 2. Yangtze Normal University， Chongqing 408100， China; 3. National Center of Important Tropical Crops Engineering and Technology Research， Wanning， Hainan 571533， China; 4. Hainan Provincial Engineering Research Center of Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract： To explore the effect of coffee pulp wine flavor and sensory quality via different exogenous additives， coffee pulp wine was made by coffee pulp added fermentable sugars （glucose， fructose， maltose and sucrose） and fermentable amino acids （glutamic and arginine） respectively， and coffee pulp wine flavor and sensory quality on exogenous additives effects was detected by headspace solid phase micro extraction gas chromatography mass spectrometry （HS-SPME-GC/MS） and human sensory analysis. The results showed that a total of 9 categories of 75 flavor components was detected and the main compounds were esters and alcohols. Fermentable sugars could increase the alcohol contents of coffee pulp wine （23.99%–121.24%） significantly， and amino acids could also increase the esters contents （25.77%–28.18%）， while the esters contents of fermented sugars were significantly reduced （10.81%–69.94%）. The homogeneity of variance was tested atP=0.206>0.05， there was no significant difference in flavor components at the level ofα=0.05， meanwhile it indicated that there was no significant difference between the samples by tukey post-hoc tests on one-way analysis of variance [P=（0.371–0.989）>0.05]， nevertheless principal component analysis （PCA， PC1： 96.01%， PC2： 3.13%） could completely distinguish them. The results of sensory evaluation with fuzzy mathematics method showed that the coffee pulp wine brewed with arginine added had the highest comprehensive score （92.40）， which was more suitable for people's taste， and had excellent overall style and preferable coordination， followed by glutamic added coffee pulp wine （80.80）. The comprehensive score of fructose and sucrose was the same （78.20）， and that of maltose was the lowest （74.20）. In summary， amino acids and fermented sugars also could improve the flavor and taste of coffee pulp wines， while the effect of adding fermented sugar was not as good as that of amino acids.

Keywords： additives; coffee pulp wine; flavor; sensory quality

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.6.020

咖啡是茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）多年生常綠灌木或小喬木，是熱帶重要的特色經(jīng)濟作物，在我國種植面積為12萬hm²，年產(chǎn)鮮果約35萬t，鮮果中約45%為果皮^[1]。Esquivel等^[2]將咖啡果皮定義為咖啡外果皮和咖啡果肉混合物，果皮含有豐富的有機營養(yǎng)物質、17種氨基酸、多種維生素和礦物質^[3]，還含有大量的生物活性組分，對慢性疾病有不同的預防和治療作用^[4]，可以作為一種新型的食品原料^[5]?？Х裙ぞ剖且钥Х裙樵习l(fā)酵生產(chǎn)的新型飲品，由于咖啡果皮是以可溶性膳食纖維、果膠和蛋白質為主^[1，3]，本身可利用的發(fā)酵糖含量較少，咖啡果皮酒風味組分含量較少，且不持久，所以要外源添加碳源和氮源以利發(fā)酵轉化。

目前對咖啡果皮酒的研究相對較少，國外未檢索到相關文獻，國內僅處于發(fā)酵工藝和發(fā)酵風味研究階段。例如，劉靜等^[6]以新鮮咖啡果肉為原料通過正交實驗及響應面分析，對其果酒釀造過程的前處理工藝及發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，得到良好的實驗效果;胡榮鎖等^[7]為探討單菌發(fā)酵對果酒風味的影響，利用GC-MS分析、電子感官（電子鼻和電子舌）和人為感官判定菌種對咖啡果皮酒整體風味的影響，并篩選到最優(yōu)的發(fā)酵菌種。未檢索到咖啡果皮酒外源物質添加研究，但其他類型果酒有報道。例如，Seguinot等^[8]研究表明利用氨基酸等作為氮源添加對發(fā)酵產(chǎn)生的香氣有影響;徐培培^[9]報道了用6種不同的初始糖量發(fā)酵對鮮食葡萄品種酒液品質的影響研究;謝克林等^[10]通過氣相色譜-質譜法對添加4種外源可發(fā)酵糖的葡萄酒進行揮發(fā)性化合物的定性定量分析;Chen等^[11]報道了3種芳香氨基酸對荔枝酒揮發(fā)性和非揮發(fā)物質的影響，發(fā)現(xiàn)氨基酸可使酒風味多樣化或強化;商玉薈等^[12]研究氨基酸添加對荔枝酒發(fā)酵動力及品質影響。除了對氨基酸和可發(fā)酵糖的研究外，添加其他組分對果酒風味的研究國內外也有報道，如Wilkowska等^[13]報道了添加糖苷酶對櫻桃酒風味的增強作用;Niu等^[14]報道了不同類型橡木對枸杞酒風味和抗氧化活性的促進作用。綜上所述，外源添加碳源和氮源能改善發(fā)酵酒風味和提升品質。

本研究擬在咖啡果皮酒的釀造過程中，分別添加4種可發(fā)酵糖（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和果糖）和2種氨基酸（谷氨酸和精氨酸），通過改善咖啡果皮酒發(fā)酵條件，達到改善咖啡果皮酒風味和品質的目的。此項研究實施可使咖啡果皮酒感官品質得到提升，為咖啡果皮酒的進一步研發(fā)和應用提供理論支持。

1? 材料與方法

1.1材料

云南小粒種咖啡（Coffea arabicaL.）果皮，由云南農業(yè)大學熱帶作物學院協(xié)助收集;纖維素酶為Celluclast 1.5?L，自黑曲霉（Aspergillus niger）中提取，購自諾維信公司（Novozymes）;葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、谷氨酸、精氨酸、麥芽汁培養(yǎng)基、硫酸、亞硫酸氫鈉、無水乙醇等均為分析純，正構烷烴（C₇～C₃₀）購自美國Supelco公司，3-辛醇標準品購自美國sigma公司。7890A-5975C氣相色譜質譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司;HS-100型自動進樣器，瑞士CTC公司。

1.2方法

1.2.1? 樣品制備方法 ?按胡榮鎖^[7]前期實驗方法制備咖啡果皮酒?？砂l(fā)酵糖是分別添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和果糖，使發(fā)酵液初始糖度達到15.00?°Brix，不添加氨基酸;氨基酸添加是使用蔗糖將發(fā)酵液糖度調整為15.00°?Brix，谷氨酸和精氨酸添加量分別為0.10?g/100mL，每種添加物做3個平行，加入樣品中進行28?℃ 120?r/min搖床發(fā)酵4?d。發(fā)酵完成后用細紗布將酒液過濾，過濾后的酒液倒入已殺菌準備好的瓶子中，盡量裝滿，密封，巴氏殺菌后保存在陰涼干燥處。

1.2.2? 咖啡果皮酒香氣成分檢測^[7]SPME前處理：取2?mL發(fā)酵好的咖啡果皮酒（按0.3?g/mL加氯化鈉），放入20 mL的頂空瓶中，50?℃下預熱20 min，插入萃取頭吸附30 min，將萃取頭插入氣相色譜進樣口，250?℃解吸附5?min。氣質條件：進樣口溫度為250?℃，柱初始溫度為50?℃，保持5?min，以5?℃/min升溫至240?℃，再以1?℃/min升溫至250?℃。載氣為氦氣，流量為1.0?mL/min，不分流進樣，進樣量為1?μL。色譜柱：DB-5MS（30.0?m×250.0?μm×0.25?μm）。離子源為EI源模式，電子轟擊能量為70 eV，離子源溫度為230?℃，接口溫度為280?℃，掃描范圍為30～350?amu。色譜庫NIST14。

1.2.3? 化合物定性定量方法? 定性方法^[15]：未知化合物定性通過以下2種方法：質譜解析后與NIST14標準譜庫比對;計算待定化合物線性保留指數(shù)（linear retention index），不確定化合物通過與參考文獻中保留指數(shù)比對。線性保留指數(shù)使用正構烷烴（C₇～C₃₀）標定，計算公式如下：

式中：LRI表示線性保留指數(shù);t_x表示待定性化合物的保留時間;t_n、t_n+1分別表示組分具有n和n+1個碳原子的正構烷烴保留時間，其中t_n+1>t_x>t_n。

定量方法^[16]：使用3-辛醇外標半定量法，默認每個化合物對3-辛醇的相對響應因子為1，為計算準確使用二氯甲烷為溶劑做3-辛醇標準曲線，得出標準曲線R²=0.9938，表示曲線擬合良好，公式如下：

式中：y表示化合物濃度，mg/L;x表示化合物峰面積。

1.2.4? 咖啡果皮酒感官檢測方法? 在咖啡果皮酒釀制過程中添加6種外源添加物分別做3個平行，釀制完成后，在明亮自然光溫度適宜的房間組織10人的品嘗小組，小組成員為自由組合，無性別、年齡、文化程度、籍貫等限制，通過用口、眼、鼻等感覺器官檢查咖啡果皮酒的感官特性，對咖啡果皮酒進行品嘗評分，評分標準見表1。

采取密碼標記后進行感官品評，將酒倒入品嘗杯中，酒在杯中的高度為1/4～1/3，約10 mL，每位成員分別對本實驗所釀制的18種咖啡果皮酒的外觀、香氣、酒味、甜味、酸味5項指標進行品嘗^[8-9]，根據(jù)感官指標進行綜合分析打分。滿分100份，得分50分為差，70分為較好，90分為良好，得分記入咖啡果皮酒品嘗評分表中。

1.3數(shù)據(jù)處理

本研究色差數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式表示，每組數(shù)據(jù)重復3次;為了驗證各外源添加樣品間變異是否顯著，采用ANOVA方法檢測多組樣本是否具有相同的總體均值（P<0.05），文中所有分析數(shù)據(jù)為各組處理重復的平均值，利用Microsoft Excel 2010進行統(tǒng)計處理，SPSS 21.0進行方差分析，各平均值利用Duncan多重比較進行差異顯著性分析（P<0.05），繪圖軟件為Origin 2018 64bit。應用Unscramble 9.7（CAMO Software AS， Norway）對果酒酯類和醇類揮發(fā)性化合物的半定量數(shù)據(jù)進行主成分分析（Principal Component Analysis， PCA）。

2? 結果與分析

2.1外源添加咖啡果皮酒風味組分分析

外源添加咖啡果皮酒樣品GC-MS掃描后離子色譜圖見圖1，化合物采用與NIST14質譜庫和NIST MS Search 2.2檢索對比來鑒定，并使用正構烷烴校正，以確定其化學組成。將不同外源添加咖啡果皮酒平行樣品比較分析，減少誤差，提高結果的準確性與可信度，并對檢測到的風味組分用3-辛醇半定量，得到結果見表2。

蔗糖是最常見的可發(fā)酵糖之一，在酒類發(fā)酵過程中被大量使用^{[6，17-19]}，本研究前期實驗也是以蔗糖為發(fā)酵糖^[7]。為便于分析，將蔗糖發(fā)酵果酒作為參考進行比較。從6種外源添加物發(fā)酵液揮發(fā)性風味物質總離子流圖譜可以看出（圖1），蔗糖咖啡果皮酒中的揮發(fā)性風味物質比較豐富，風味物質揮發(fā)時間集中在15～38 min，在峰高、峰面積上有較明顯變化，揮發(fā)性成分沒有顯著差異。對比幾種不同添加物的咖啡果皮酒，精氨酸咖啡果皮酒的風味物質最豐富，整體感覺最佳。

6種外源添加物咖啡果皮酒檢出化合物75種（表2），主要包括醇類24種、酯類23種、酸類9種、酮類5種、萜烯類2種、醛類3種、烷類1種、酚類4種和4種其他化合物，共同擁有化合物50種，其含量占化合物總含量的94.55%～ 98.84%（96.77±1.51），可見不同的外源添加物會對咖啡果皮酒的風味造成一定的影響。

化合物類別分析見圖2，由圖可知醇類化合物是果酒中最主要的揮發(fā)性成分，主要由酵母代謝和糖苷與酯的水解作用形成^[20]，共鑒別出24種，占總揮發(fā)性風味物質的39.87%～70.19%（58.12± 11.05），含量較多的化合物分別為乙醇、異戊醇和苯乙醇，其中各外源添加物果酒乙醇含量差異顯著（P<0.05），可以看出不同外源糖由于糖苷的不同對醇類的影響較大（57.09±14.09），而精氨酸和谷氨酸添加會顯著促進乙醇的產(chǎn)生^[21][外源糖（42.28±28.75），外源氨基酸（106.47±4.57）]，且不同氨基酸對醇類的影響作用不同。總醇的含量大小依次為谷氨酸組（357.95?mg/L）>精氨酸組（356.96?mg/L）>果糖組（282.16?mg/L）>麥芽糖組（276.04?mg/L）>蔗糖組（200.60?mg/L）>葡萄糖組（161.76?mg/L），該結論除氨基酸外，可發(fā)酵糖果酒酒樣醇類含量的順序與謝克林等^[10]的報道一致，但本研究醇類含量則比上述研究高。

酯類化合物是構成果酒香氣的重要組成部分，對酒的主體香型及風格具有重要的影響，它們賦予果酒果香和花香的感官特性。共檢出酯類化合物23種，占總揮發(fā)性風味物質的11.23%～ 33.62%（27.14±9.80），主要為山梨酸乙酯和4-己烯酸乙酯（其他同分異構體），氨基酸對酯類的形成也有促進作用?？傰ズ看笮∫来螢楣劝彼峤M（188.36 mg/L）>精氨酸組（184.82 mg/L）>葡萄糖組（146.95?mg/L）>蔗糖組（131.07?mg/L）>果糖組（80.15 mg/L）>麥芽糖組（44.18 mg/L）。由于酯類主要由原料和酵母代謝過程產(chǎn)生，所以氨基酸可促進酯類組分含量的形成，且不同可發(fā)酵糖對酵母代謝酯類組分含量影響顯著^[10]。

酸類化合物是在酒精發(fā)酵過程中酶促反應形成的，對酒體起到一定呈味助香的作用，能形成水果、奶酪、脂肪及腐敗味的氣息，因此酸類組分是酒體中不可或缺的，但含量過高會有負面影響。在本實驗中共檢出酸類組分9種，其含量占總揮發(fā)性組分的5.69%～17.60%（11.79±4.84），其中主要的2種酸為辛酸和（E）-3-乙烯酸?？偹岷看笮∫来螢槠咸烟墙M（71.42?mg/L）>麥芽糖組（62.77?mg/L）>谷氨酸組（51.13 mg/L）>蔗糖組（47.53 mg/L）>果糖組（45.73 mg/L）>精氨酸組（33.19 mg/L）。

醇類、酯類和酸類化合物組分是構成果酒風味的主要組分，本實驗中3類組分占揮發(fā)性組分總含量的93.68%～98.69%（97.05±1.83）。發(fā)酵的酒體中還發(fā)現(xiàn)了萜烯類化合物，其在酒中是功能性化合物，具有抗菌活性、抗氧化活性等功效^[22]。在6種外源添加果酒酒樣中均檢出雪松烯，含量在0.20～0.86?mg/L，僅在葡萄糖和蔗糖的果酒酒樣中發(fā)現(xiàn)了α-蒎烯，質量濃度分別為1.41、0.17?mg/L。

2.2差異性分析

以不同外源添加檢測的風味組分為基礎進行單因素方差分析，所得的結果見表3。方差齊性檢驗結果，從顯著性概率看，P=0.206>0.05，說明各外源添加的方差在α=0.05的水平上沒有顯著性差異，即方差具有齊整性。使用LSD法對樣品進行事后兩兩比較，在顯著水平0.05下，樣品間P=（0.371～0.989）>0.05，說明樣品間差異不顯著（表4）。

醇類和酯類是咖啡果皮酒風味的主體組分，以醇類和酯類組分進行PCA分析，主成分分析圖見圖3，化合物和添加組分編號見表2，可以看出雖然樣品間差異不顯著，但主成分仍能將其較好的區(qū)分，累積貢獻率為98%>85%，屬于有效提取，基本上表達了樣品的全部信息。

由圖3可以看出，以PC1為基準大致分為3組，谷氨酸和精氨酸一組，果糖和麥芽糖一組，蔗糖和葡萄糖一組;以PC2為基準，可分為3組，果糖組、麥芽糖組、其余4種一組。精氨酸和谷氨酸位于第1象限，與其相關為7種醇類和12種酯類化合物;

蔗糖和葡萄糖位于第2象限，與之相對應的為6種醇類和8種酯類化合物;麥芽糖位于第3象限，與之相對應的為5種醇類和2種酯類;果糖位于第4象限，與之相對應的為6種醇類和1種酯類，這可能是由于不同糖和氨基酸對酵母代謝造成了不同的影響，使果酒風味多樣化。

2.3不同種類添加物對發(fā)酵咖啡果皮酒感官分析

外源添加釀造咖啡果皮酒色度結果見表5，

葡萄糖咖啡果皮酒明亮度最高（38.64）更加的澄清透明，精氨酸咖啡果皮酒明亮度（36.32）則相對欠缺，葡萄糖咖啡果皮酒與其他幾種果酒色澤明亮度差異顯著（P<0.05，n=3）。精氨酸咖啡果皮酒紅色度最高（2.26），葡萄糖紅色度最低（0.59）。谷氨酸果酒的黃色度和彩度方面都高于其他幾種果酒，與精氨酸咖啡果皮酒無明顯差異。綜上所述，添加精氨酸釀造的咖啡果皮酒比其他幾種色澤更加濃郁。

2.4不同外源添加物對發(fā)酵咖啡果皮酒感官分析

對食品感官質量進行模糊數(shù)學法評判時，權重的分配方案會直接影響最后評價結果的正確性。權重集表示各評價因素權重系數(shù)的集合。每個評價因素對應一個權重系數(shù)，通常用A表示。本實驗采用強制決定法確定咖啡果皮酒各感官指標權重^[23]，A={A_外觀，A_香氣，A_酒味，A_甜味，A_酸味}= {0.20， 0.30， 0.20， 0.20， 0.10}。

將表6中的6種咖啡果皮酒感官因素的各等級評價人數(shù)分別除以總評價人數(shù)，得到模糊矩陣R。由表6可得：以編號為1的蔗糖咖啡果皮酒為例，即建立外觀、香氣、酒味、甜味和酸味，5個單因素的模糊評價矩陣：U_外觀=[0.70 0.30 0.00]，U_香氣=[0.50 0.50 0.00]，U_酒味=[0.40 0.40 0.20]，U_甜味=[0.50 0.20 0.30]，U_酸味=[0.50 0.40 0.10]。將上述對1號樣品的5個單因素評價結果寫成一個模糊矩陣。

即Y₁=（0.52，0.37，0.11）。同理，可得其他幾組樣品的模糊評價結果。好、中、差3個等級分別賦值為90、70、50。將Y中的各個量乘以相對應的分值，再加和，得到最后感官評價值。

表7為添加5種不同添加物的感官評價表，添加精氨酸所釀造的果酒綜合得分最高，更加適合人們的口味，整體風格顯著，協(xié)調性好。添加麥芽糖果酒得分最低，總體得分和排名低于其他幾種物質，添加果糖和蔗糖所釀造的咖啡果皮酒綜合評分一致，說明兩者口感很接近，幾乎沒什么區(qū)別。其中，精氨酸所釀造的果酒在酒味指標上明顯高于其他果酒，酒香更加的濃郁。添加谷氨酸的果酒在外觀上有明顯優(yōu)勢，添加果糖與蔗糖的果酒在甜味上存在極大的優(yōu)勢。簡而言之，不同的添加物都有優(yōu)勢與不足，為后續(xù)研究混合添加發(fā)酵奠定基礎。

3? 討論

分別添加4種可發(fā)酵糖（葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖）和2種可發(fā)酵氨基酸（精氨酸和谷氨酸）發(fā)酵生產(chǎn)的咖啡果皮酒，經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)75種風味組分，共有組分50種，可見添加不同外源使咖啡果皮酒的風味多樣化，這一結論與徐培培^[9]、謝克林等^[10]的文獻一致。醇類和酯類同樣是咖啡果皮酒的主體組分，添加氨基酸能增加醇類和酯類組分，商玉薈等^[12]、Chen等^[11]的研究也表現(xiàn)出同樣的結論，可見添加外源糖和氨基酸能改善并強化咖啡果皮酒的風味。4種糖發(fā)酵果酒的醇酯結構不同，不同糖添加具有風味各異的類型^[10]，但感官評價得分相差不顯著，因此4種可發(fā)酵糖均可用來作為發(fā)酵原料，但從其風味類型和經(jīng)濟指標來看，今后實驗原料仍以蔗糖作為可發(fā)酵糖。

通過模糊數(shù)學法評判咖啡果皮酒風味時，添加精氨酸所釀造的果酒綜合得分最高，更加適合人們的口味，整體風格顯著，協(xié)調性好，谷氨酸次之。氨基酸添加效果高于可發(fā)酵糖，其原因應該是添加氨基酸增加了氮源，促進了發(fā)酵的進行，雖然果酒中風味組分中含氮組分較少，但酵母菌增殖需要適當?shù)卦黾拥唇M分^[24]。由此可知現(xiàn)有發(fā)酵體系中碳氮比失衡，氮源的缺失并未使釀酒酵母的發(fā)酵能力達到最佳^[25]，特別是乙醇的生產(chǎn)能力^[26]，添加氨基酸組乙醇含量普遍高于未添加組。本研究中精氨酸和谷氨酸添加組風味組分種類和含量不存在顯著性差異，但兩者感官得分相差明顯，可見發(fā)酵菌群對氮源也有一定的選擇性^[27]，最佳氮源的添加種類和含量需要進一步驗證。

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