任群利 廖成成 劉建國

摘要 ? ?本文以雄性昆明小鼠為試驗動物，通過比較小鼠血清中尿酸、尿素氮、肌酐的含量，檢測肝腎和血清中的黃嘌呤氧化酶，以及觀察肝腎組織病理特征，研究茶多酚對氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的小鼠高尿酸血癥的治療作用。結(jié)果表明，與模型組相比，茶多酚高劑量組（600 mg/kg）高尿酸血癥小鼠血清中尿酸含量極顯著減少約33.7%，茶多酚中劑量（300 mg/kg）和低劑量組（150 mg/kg）均極顯著減少約28.5%，別嘌醇組（10 mg/kg）極顯著減少99.5%（P<0.01）。茶多酚中、高劑量組能降低血清尿素氮、肌酐含量;同時，肝、腎中黃嘌呤氧化酶活性分別極顯著降低50%、64%（P<0.01）。病理組織形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，別嘌醇組小鼠肝臟有一定損傷，腎臟有中度病理組織學(xué)改變;模型組和茶多酚各劑量組小鼠肝臟損傷影響不大，僅有輕度水腫;模型組小鼠腎臟損傷較輕，茶多酚低劑量組可見小鼠腎臟輕度病理組織學(xué)改變，茶多酚中、高劑量組未見明顯變化。由此可知，茶多酚能顯著降低氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠血尿酸水平，可能與抑制尿酸的生成和促進排泄相關(guān)。同時，茶多酚對小鼠肝腎組織具有一定的保護作用。

關(guān)鍵詞 ? ?茶多酚;小鼠;尿酸;高尿酸模型;病理組織

中圖分類號 ? ?R151 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）13-0200-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）

Abstract ? ?The male Kunming mice were used as experimental animals in this paper， the therapeutic effect of tea polyphenols on hyperuricemia mice induced by potassium oxyzinate by comparing the serum uric acid， urea nitrogen and creatinine contents of the mice， detecting the xanthine oxidase in liver， kidney and serum， and observing the pathological features of liver and kidney tissue was studied. The results showed that compared with model group， the content of serum uric acid in tea polyphenols high dose group （600 mg/kg） significantly decreased by about 33.7%， in the tea polyphenols middle dose group （300 mg/kg） and low dose group （150 mg/kg） all significantly decreased by about 28.5%， in the allopurinol group （10 mg/kg） significantly decreased by 99.5% （P<0.01）. The contents of serum urea nitrogen and creatinine decreased in tea polyphenols middle and high dose groups; and the activities of xanthine oxidase in liver and kidney were significantly reduced by 50% and 64% （P<0.01）， respectively. Pathomorphological exami-nation showed that the liver was damaged to a certain extent in allopurinol group， the kidney had moderate pathological changes; the liver damage was not significant in model group and tea polyphenol groups， with slight edema; the kidney injury was slight in model group， slight histopathological changes were observed in tea polyphenols low dose group， while no significant changes were observed in tea polyphenols middle and high dose groups. Therefore， tea polyphenols can significantly reduce the serum uric acid level of hyperuricemia mice induced by potassium oxyzinate， it may be associated with inhibiting the generation and promoting the excretion of uric acid. At the same time， tea polyphenols has a certain protective effect on the liver and kidney tissue of mice.

Key words ? ?tea polyphenols; mice; uric acid; hyperuricemia model; pathological tissue

高尿酸是痛風(fēng)的生化基礎(chǔ)，還與高血壓、冠心病、代謝綜合征、糖尿病等疾病密切相關(guān)[1-2]。近年來，隨著生活水平的提高，高尿酸血癥患者顯著增多，并呈現(xiàn)年輕化的發(fā)展趨勢。目前，治療藥物有秋水仙堿、別嘌醇等，但存在引起肝腎功能損害、造血功能異常等副作用[3-4]。茶是世界三大飲料之一，在我國飲用歷史悠久[5]，具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗癌抗腫瘤等活性，各國研究人員也在不斷對其更多生物活性功能進行研究開發(fā)。茶多酚（Tea Polyphenols，TP）是從茶葉中提取的一類主要活性成分，是包括兒茶素、花青素、黃酮與黃酮醇類和酚酸類等多酚化合物的總稱[6-7]。據(jù)報道，茶多酚對治療高尿酸血癥有一定效果[6-8]，但其相關(guān)機制及對肝腎組織的安全性尚未明確。

本文采用小鼠灌胃氧嗪酸鉀（Potassium Oxonate，PO）建立高尿酸血癥模型，對其茶多酚抗高尿酸作用進行研究，并與別嘌醇進行對比，探討茶多酚對小鼠尿酸水平及肝腎組織的影響，以期為茶多酚及相關(guān)產(chǎn)品的進一步開發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗動物

昆明種小鼠，體重18～22 g，雄性，購于重慶騰鑫生物技術(shù)有限責(zé)任公司（合格證編號：SCXK（京）2014-0004），飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院。飼養(yǎng)環(huán)境為自然光照，通風(fēng)良好，溫度（23±2）℃。試驗開始前分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境7 d，整個試驗過程自由進食和飲水。

1.2 ? ?藥品與試劑

茶多酚（批號：TP988DA，純度98%，遵義陸圣康源科技開發(fā)有限責(zé)任公司），別嘌醇（批準文號：國藥準字H440213

68，廣東彼迪藥業(yè)有限公司），氧嗪酸鉀（批號：627G021，純度≥90%，北京索萊寶科技有限公司），甲醛（批號：20180802

01，成都市科隆化學(xué)品有限公司），黃嘌呤氧化酶試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 ? ?儀器與設(shè)備

ME104E/02電子天平，由梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn);CS-600B全自動生化分析儀，由長春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司生產(chǎn);PE Lambda265紫外可見分光光度計，由PerkinElmer股份有限公司生產(chǎn);DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋，由天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn);DW-86L386 立式超低溫保存箱高速，由青島海爾特種電器有限公司生產(chǎn);Multifuge X1R冷凍離心機，由賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產(chǎn);985370EUR-07，-04組織破碎儀，由妙生科技有限公司生產(chǎn);DM400B顯微鏡，由德國Leica公司生產(chǎn)。

1.4 ? ?溶液制備

1.4.1 ? ?茶多酚溶液的制備。分別精密稱取茶多酚干燥粉末0.375、0.750、1.500 g，溶解于蒸餾水50 mL中，制備成質(zhì)量濃度分別為7.5、15.0、30.0 mg/mL的茶多酚溶液。

1.4.2 ? ?別嘌醇溶液的制備。將別嘌醇片25 mg放入研缽內(nèi)研成細末，然后溶解于50 mL蒸餾水中，制備成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的別嘌醇溶液。

1.4.3 ? ?氧嗪酸鉀（PO）溶液制備。稱取氧嗪酸鉀粉末1.875 g，溶解于150 mL蒸餾水中，制備成質(zhì)量濃度為12.5 mg/mL的溶液。

1.5 ? ?試驗設(shè)計

將48只昆明小鼠隨機分成6組，分別為茶多酚（TP）低劑量組、茶多酚（TP）中劑量組、茶多酚（TP）高劑量組、別嘌醇組、空白組和模型組，每組8只。造模、給藥方法及所用的PO、茶多酚及別嘌醇等濃度參照文獻記載[6-12]。以空白組為對照，模型組和茶多酚組每天9：00開始給予PO 250 mg/kg灌胃造模、10：00進行給藥處理。其中，茶多酚低、中、高劑量組分別采用茶多酚溶液150、300、600 mg/kg灌胃處理，別嘌醇組采用別嘌醇溶液10 mg/kg灌胃處理，模型組給予等量生理鹽水。灌胃給藥體積均為20 mL/kg，連續(xù)用藥7 d。

1.6 ? ?試驗方法

1.6.1 ? ? 指標測定。依據(jù)文獻所述方法[7，11]，末次給藥前2 h斷食，給藥1 h后，乙醚麻醉小鼠后摘除眼球采血，于4 ℃下靜置過夜，3 000 r/min離心10 min，取血清保存于-80 ℃條件下待測。取小鼠肝臟，稱取約0.1 g組織，加入1 mL試劑盒提取液，進行冰浴勻漿，8 000 g于4 ℃條件下離心10 min，取上清液保存于-80 ℃下待測。用前4 ℃解凍，用全自動生化分析儀檢測出血清尿酸值（Uric Acid，UA）、尿素氮（Blood Ur-ea Nitrogen，BUN）含量、肌酐（Serum Creatinine，Scr）含量和用試劑盒測定肝臟單位蛋白質(zhì)條件下的黃嘌呤氧化酶（Xa-nthine Oxidase，XOD）活性。

1.6.2 ? ?臟器指數(shù)測定。于試驗結(jié)束脫頸處死小鼠，取肝臟和腎臟稱重，計算臟器指數(shù)。計算公式如下：

臟器指數(shù)=臟器重量/小鼠體重×100

1.6.3 ? ?肝腎組織病理學(xué)檢查。取小鼠肝和腎臟器組織，配置10%中性甲醛溶液進行固定，梯度乙醇脫水，透明，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色，600倍光鏡下觀察組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.7 ? ?數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組比較用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較用LSD-t檢驗。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?茶多酚對高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響

由表1可知，與空白組相比，模型組小鼠尿酸極顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，各給藥組小鼠血清尿酸含量均有下降趨勢，茶多酚低、中劑量組小鼠血清尿酸水平接近空白組，較模型組均極顯著減少約28.5%（P<0.01）;別嘌醇陽性藥能顯著降低高尿酸血癥小鼠的尿酸水平，極顯著減少99.5%（P<0.01）。

2.2 ? ?茶多酚對高尿酸血癥小鼠血清BUN、Scr水平的影響

由表2可知，與空白組相比，模型組小鼠BUN升高，但差異不顯著（P>0.05）;與模型組比較，茶多酚各劑量組小鼠BUN含量均下降（P>0.05），別嘌醇組小鼠BUN含量極顯著升高（P<0.01）。模型組小鼠Scr含量較空白組高（P>0.05）;與模型組比較，茶多酚中、高劑量組Scr含量均下降（P>0.05），別嘌醇組小鼠Scr含量顯著升高（P<0.05）。

2.3 ? ?茶多酚對高尿酸血癥小鼠肝臟和血清中黃嘌呤氧化酶活性的影響

由表3可知，灌胃PO后，小鼠肝臟和血清黃嘌呤氧化酶活性較空白組有所升高，給予別嘌醇陽性藥后，黃嘌呤氧化酶活性均有下降趨勢;與模型組相比，茶多酚各劑量組肝臟和血清黃嘌呤氧化酶活性均有下降趨勢，茶多酚中、高劑量組肝臟黃嘌呤氧化酶活性極顯著降低 50%、64%（P<0.01）。

2.4 ? ?茶多酚對高尿酸血癥小鼠肝、腎臟器指數(shù)的影響

由表4可知，與空白組相比，模型組小鼠和茶多酚各劑量組小鼠肝臟和腎臟指數(shù)均無明顯差異，別嘌醇組小鼠肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)均升高，腎臟系數(shù)具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.5 ? ?小鼠肝臟形態(tài)及組織病理檢查

由圖1可知，各試驗組小鼠肝外觀及切面正常，染色均勻，肝細胞形態(tài)正常，細胞核無改變。與空白組相比，模型組小鼠肝細胞輕度水腫，細胞分布不均勻;別嘌醇組小鼠肝細胞中度水腫并有炎性細胞的浸潤，有小灶狀壞死;茶多酚各劑量組小鼠肝細胞輕度水腫，細胞核無區(qū)別，細胞無壞死，肝組織恢復(fù)程度與劑量呈正相關(guān)關(guān)系。

2.6 ? ?小鼠腎臟形態(tài)及組織病理檢查

由圖2可知，空白組、模型組、茶多酚各劑量組小鼠腎外觀及切面正常，別嘌醇組小鼠腎外觀均充血明顯。各組小鼠可見腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)清楚，形態(tài)和染色基本正常。模型組和別嘌醇組腎小管間質(zhì)毛細血管擴張充血;別嘌醇組較模型組明顯有少量炎性細胞滲出，上皮細胞空泡變性;茶多酚各劑量組腎組織無明顯改變，無炎性細胞，腎小球及近端腎小管組織結(jié)構(gòu)清楚，球囊表面無粘連，低劑量組個別區(qū)域腎小管上皮細胞輕度水腫、毛細血管輕度擴張充血，中劑量組和高劑量組無明顯變化。

3 ? ?結(jié)論與討論

高尿酸血癥是血尿酸升高的病變，是引起痛風(fēng)病理發(fā)病的危險因素[13]，小鼠灌胃氧嗪酸鉀，氧嗪酸鉀可競爭性地與尿酸酶結(jié)合，部分抑制尿酸酶活性，抑制小鼠體內(nèi)尿酸分解，造成高尿酸血癥模型[14]。因其造模安全、對腎臟損傷較小，構(gòu)建的模型具有較高血尿酸水平且較持續(xù)、穩(wěn)定，故試驗大多采用此方法。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組小鼠尿酸值極顯著升高（P<0.01），表明高尿酸血癥造模成功;與模型組比較，各給藥組血清尿酸均有下降趨勢，茶多酚中劑量組和低劑量組血清尿酸水平接近空白組、高劑量組極顯著低于空白組（P<0.01），別嘌醇陽性藥能極顯著降低高尿酸血癥小鼠的尿酸水平（P<0.01），表明茶多酚具有降低血尿酸水平作用，別嘌醇的降尿酸作用較茶多酚大。尿酸是嘌呤堿代謝終產(chǎn)物，嘌呤代謝過程中相關(guān)酶活性的增強是尿酸增多的主要原因，機體內(nèi)XOD含量最高的器官是肝臟。試驗表明，氧嗪酸鉀導(dǎo)致模型組小鼠肝臟和血清XOD活性升高，產(chǎn)生高尿酸;別嘌醇和茶多酚能降低小鼠肝臟和血清XOD活性。腎臟是血尿酸水平調(diào)節(jié)的重要器官，人體每天產(chǎn)生的尿酸2/3經(jīng)由腎臟通過尿液排出體外，血清Scr和BUN濃度作為檢測指標用以反映動物腎功能情況。試驗結(jié)果表明，造模后試驗小鼠血清Scr和BUN明顯升高，灌胃別嘌醇后血清Scr和BUN明顯升高，灌胃茶多酚后無明顯變化，反映出別嘌醇對試驗動物腎功能造成了損害，經(jīng)腎臟排出的Scr和BUN減少，血中濃度升高，茶多酚對試驗動物腎臟無明顯影響。為了進一步觀察茶多酚對肝、腎功能是否產(chǎn)生影響，本試驗對空白組、模型組、別嘌醇組及茶多酚各劑量組肝、腎組織進行了病理檢查。研究表明，造模對小鼠肝腎組織有輕微損傷;茶多酚對肝腎組織無明顯影響，并且有適當(dāng)保護作用，效果與劑量呈正相關(guān)關(guān)系;別嘌醇對小鼠肝臟有輕度損傷，對腎臟有中度損傷，并且腎臟指數(shù)顯著升高（P<0.05）。

綜上所述，氧嗪酸鉀對肝腎組織無明顯影響，茶多酚對高尿酸血癥小鼠的作用與劑量成正相關(guān)，能顯著降低氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠血尿酸水平。機制可能是通過抑制小鼠肝臟和血清XOD活性從而抑制尿酸的生成和促進排泄，對小鼠肝腎組織具有一定保護作用。茶多酚降尿酸效果不及別嘌醇明顯，但毒副作用低，是天然中藥成分。本研究為將別嘌醇作為降尿酸藥物的同時，添加茶多酚作補充保護藥物或開發(fā)茶多酚為新的降尿酸藥物提供了理論參考。

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