潘峰 侯凱 劉云 吳衛(wèi)

（1. 遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義563000；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

多糖（Polysaccharide）是一類由10個(gè)以上單糖分子脫水聚合，以糖苷鍵連接，可形成直鏈或有分支的長(zhǎng)鏈，水解后得到相應(yīng)的單糖和寡糖的大分子化合物。雖然多糖種類豐富，結(jié)構(gòu)多樣，也是除核酸、蛋白質(zhì)之外的另一類重要的生物大分子，但對(duì)多糖的研究遠(yuǎn)滯后于核酸和蛋白質(zhì)，最主要原因是多糖本身的復(fù)雜性。與核酸、蛋白質(zhì)相比，組成多糖的單糖有更多活性基團(tuán)和手性原子，單糖間有多種連接方式，可形成直鏈或分支，還有多種異構(gòu)體、衍生物等，使多糖具有豐富的多樣性，大部分多糖具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。而且，多糖鏈有較高柔韌性和親水性，易受環(huán)境影響發(fā)生空間構(gòu)象變化，在復(fù)雜的一級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，存在大量的分子間作用。結(jié)構(gòu)的多樣性使天然多糖具有諸多的生物活性，并廣泛參與細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞生長(zhǎng)、組織分化、新陳代謝、胚胎發(fā)育等生命過程［1］。自從20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)真菌多糖具有抗癌作用以來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多糖類化合物具有免疫調(diào)節(jié)、抗突變、降血脂、降血糖、抗病毒、抗凝血、抗?jié)兒涂寡趸壬锘钚裕?］。

植物內(nèi)生真菌（Endophytic fungi）是指在其全部或部分生活史中存活于健康植物組織內(nèi)，而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的一類真菌［3］。通常，根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)外不同存在形式可分為:分泌到培養(yǎng)基的胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS），黏附在細(xì)胞壁表面的胞壁多糖和在細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)多糖。目前，內(nèi)生真菌和糖生物學(xué)是兩個(gè)研究熱點(diǎn)，內(nèi)生真菌多糖（The polysaccharide from endophytic fungi，PSEF）作為二者的交叉內(nèi)容也越來越受到人們的關(guān)注，相關(guān)報(bào)道也越來越多。已有研究表明PSEF具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌等功能［4-6］。加強(qiáng)PSEF研究不僅可獲得更多具有新型結(jié)構(gòu)和廣泛活性的天然多糖產(chǎn)物，也能夠幫助人們更深入理解內(nèi)生真菌與其宿主間的關(guān)系和相互作用機(jī)理，從而在一定程度上改善植物生長(zhǎng)。

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),內(nèi)生真菌均可產(chǎn)生多糖，但種類、產(chǎn)量和活性等差異較大，內(nèi)生真菌多糖生物合成具有明顯菌株差異性［7］。選擇產(chǎn)量高，活性好的菌株是研究PSEF的第一步。PSEF多是水溶性的EPS，故對(duì)內(nèi)生真菌水提物重量和活性測(cè)定，可初步了解多糖的產(chǎn)量和活性。但要獲取多糖的結(jié)構(gòu)信息，必須純化后才可進(jìn)一步研究。目前，人們可從內(nèi)生真菌的發(fā)酵液、菌絲體等獲得多種多糖成分（表1）。這也表明內(nèi)生真菌可產(chǎn)生種類多樣具有一定生物活性的多糖成分。

1 產(chǎn)多糖內(nèi)生真菌培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基成分，如碳源、氮源、無機(jī)離子、氧含量等都會(huì)明顯影響PSEF產(chǎn)生。在確定發(fā)酵菌株后，配制合適的培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生真菌生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成非常重要。

碳源（Carbonsource）是微生物營(yíng)養(yǎng)所需碳元素（碳架）的營(yíng)養(yǎng)源［27，31］。其來源廣泛，但不同微生物利用碳源具有偏好性。其中，利用最廣泛的是糖類；其次是醇類、有機(jī)酸類和脂類。在糖類中，單糖勝于雙糖和多糖；已糖勝于戊糖；葡萄糖、果糖勝于甘露糖、半乳糖。在多糖中，淀粉優(yōu)于纖維素或幾丁質(zhì)等純多糖；純多糖則優(yōu)于瓊脂等雜多糖和其它聚合物（如木質(zhì)素）。目前，內(nèi)生真菌所選用的發(fā)酵培養(yǎng)基多為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDB）培養(yǎng)基，其中主要碳源為土豆淀粉，不僅價(jià)格便宜，而且淀粉含量高。除淀粉外，一般會(huì)添加適量單糖或寡糖作為補(bǔ)充。如Subhadip等［32］通過單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、棉子糖中，當(dāng)添加鼠李糖時(shí)，最有利于菌絲生長(zhǎng)，添加葡萄糖時(shí)最有利于EPS的產(chǎn)生。此外，Wang等［33］研究發(fā)現(xiàn)通過添加甘油或粗甘油可促進(jìn)內(nèi)生真菌Chaetomium globosumCGMCC 6882多糖生產(chǎn)能力，其中甘油可能就是作為一種碳源物質(zhì)影響其產(chǎn)多糖能力。

氮源（Nitrogensource）是微生物生長(zhǎng)繁殖所需氮元素的營(yíng)養(yǎng)源［27］。在真菌合成蛋白質(zhì)、核酸、生物堿等代謝產(chǎn)物，以及調(diào)節(jié)酶活性等生化反應(yīng)中具有不可替代的作用。與碳源相似，真菌能利用的氮源種類即氮源譜也十分廣泛。一般來說，內(nèi)生真菌等異養(yǎng)微生物對(duì)氮源利用的順序是:“N·C·H·O”或“N·C·H·O·X”類有機(jī)氮源（如酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨、尿素、甘氨酸和NH4NO3）優(yōu)于“N·H”類無機(jī)氮源（如NH4Cl），更優(yōu)于“N·O”或“N·O·X”類（如NaNO3、NO2），而最不易被利用的則是“N”類（如N3）。酵母提取物、麥芽提取物、蛋白胨等有機(jī)氮源也是內(nèi)生真菌培養(yǎng)基中主要添加的氮源［8，18，27］?？梢姡袡C(jī)氮源比無機(jī)氮源更適合內(nèi)生真菌生產(chǎn)多糖。這可能是有機(jī)氮源能夠提供豐富的易分解的蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素等物質(zhì)，滿足內(nèi)生真菌在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期對(duì)氮源的需求。

無機(jī)鹽離子對(duì)內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的形成也必不可少。Subhadip等［32］研究不同種類的無機(jī) 鹽（HgCl2、MnCl2、FeCl3、KCl、BaCl2、NaCl、CaCl2、MgCl2）對(duì)內(nèi)生真菌Fusarium solaniSD5 菌絲體生物量和EPS產(chǎn)量的影響發(fā)現(xiàn)，HgCl2和FeCl3顯著抑制菌絲的生長(zhǎng)和EPS的產(chǎn)生，KCl、CaCl2、MgCl2和NaCl都可促進(jìn)菌絲量和EPS量的增加，其中KCl效果最好?？梢?，Hg2+和Fe3+對(duì)此內(nèi)生真菌具有毒性，而且Hg2+可用于內(nèi)生真菌的分離過程中的植物樣品表面消毒。K+、Ga2+、Mg2+和Na+等離子通常參與調(diào)節(jié)細(xì)胞中一些酶的活性，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓，調(diào)節(jié)pH和氧化還原電位等。此外，當(dāng)在F. solaniSD5的培養(yǎng)基中添加KH2PO4（0.05 g/L）時(shí)，EPS也會(huì)明顯增加［32］。這可能是磷酸鹽參與EPS合成關(guān)鍵酶的磷酸化和去磷酸化或者在可控制物質(zhì)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)proton-ATPase發(fā)揮作用。

表1 不同植物內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)多糖

培養(yǎng)基的pH值也會(huì)影響PSEF的產(chǎn)生。例如，Pestalotiopsissp. BC55在培養(yǎng)基初始pH值從4-8的變化中，其EPS產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加，后降低的規(guī)律，在pH為4時(shí)最小，在pH為7時(shí)最大，其生物量和EPS產(chǎn)量分別增加了3.5倍和6.9倍，隨后通過響應(yīng)面法分析，其最佳pH值為6.93［26］。對(duì)初始pH值的優(yōu)化結(jié)果表明，內(nèi)生真菌產(chǎn)EPS的最佳培養(yǎng)基初始pH值在5-7之間，過酸或過堿的環(huán)境都不利于PSEF的產(chǎn)生。

氧氣也參與到內(nèi)生真菌發(fā)酵代謝過程中。培養(yǎng)基中合適的氧含量對(duì)內(nèi)生真菌正常生長(zhǎng)，代謝產(chǎn)物的合成、運(yùn)輸和分泌等都有影響。目前除專業(yè)的發(fā)酵罐可直接控制培養(yǎng)基中氧氣含量外，在普通搖瓶中較難實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控制，但通過控制搖瓶中培養(yǎng)基體積和轉(zhuǎn)速可間接控制培養(yǎng)基與空氣接觸面積，從而影響氧氣進(jìn)入培養(yǎng)基的含量。例如，對(duì)內(nèi)生真菌Pestalotiopsissp. BC55的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向320 mL的發(fā)酵瓶中添加75 mL培養(yǎng)基時(shí)，其菌絲生物量和EPS產(chǎn)量均達(dá)到最高，分別較最低值提高了1.3倍和 13.2 倍［26］。

發(fā)酵時(shí)間和培養(yǎng)溫度對(duì)PSEF產(chǎn)生有顯著影響。內(nèi)生真菌菌絲生長(zhǎng)和多糖等代謝物的產(chǎn)生等生理生化過程均需在一定時(shí)間完成。不同培養(yǎng)時(shí)間，對(duì)PSEF產(chǎn)量、水提物中多糖含量、蛋白質(zhì)含量、多糖類型和多糖生物活性均有不同影響。例如，分離自胡椒健康葉片中的內(nèi)生真菌Diaporthesp. JF766998在培養(yǎng)了72、96和168 h后，其粗多糖產(chǎn)量分別為3.0、15.4和14.8 mg/100 mL發(fā)酵液；而且隨著時(shí)間增加，總多糖含量從71%增加到99.8%，蛋白質(zhì)含量也從28.5%下降到0%；對(duì)于單糖組成，在培養(yǎng)72 h時(shí)，葡萄糖占84%，隨著時(shí)間增加，其下降到30%，而半乳糖和甘露糖的含量明顯增加［34］。一般發(fā)酵時(shí)間在4-30 d之間。通常，為提高發(fā)酵效率，降低發(fā)酵時(shí)間，先通過小規(guī)模發(fā)酵，在真菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期轉(zhuǎn)接到大規(guī)模發(fā)酵瓶中，此時(shí)，內(nèi)生真菌生長(zhǎng)活力較強(qiáng)，繁殖迅速，可縮短后期發(fā)酵所需時(shí)間。培養(yǎng)溫度可通過影響酶活性，改變內(nèi)生真菌代謝速率，甚至導(dǎo)致某些代謝過程出現(xiàn)或終止，影響多糖產(chǎn)生，所以合適的培養(yǎng)溫度非常重要。由表1可見，盡管不同內(nèi)生真菌發(fā)酵溫度略有不同，但是大多數(shù)基本處于20-28℃之間，溫度過低或者過高均不利于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)和多糖積累［26］。

總之，影響內(nèi)生真菌生長(zhǎng)和PSEF產(chǎn)量的因素存在差異，不同內(nèi)生真菌受不同因素影響大小有所區(qū)別。例如，對(duì)內(nèi)生真菌Berkleasmiumsp. Dzf12 EPS培養(yǎng)基研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、蛋白胨和MgSO4·7H2O濃度是影響EPS產(chǎn)生的關(guān)鍵因子［35］。對(duì)內(nèi)生真菌F.solaniSD5發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)表明葡萄糖濃度（g%）、酵母抽提物濃度（g%）、培養(yǎng)基pH值和發(fā)酵天數(shù)是影響EPS產(chǎn)生的顯著因素（P＜0.05）［32］。目前，為得到最佳培養(yǎng)基和最適發(fā)酵條件，主要通過響應(yīng)面分析（Response surface methodology，RSM）來完成，即先通過單因素試驗(yàn)及部分因子設(shè)計(jì)（Fractional factorial design，F(xiàn)FD）找出最主要的影響因素和其影響范圍，然后利用最陡上升法、最陡下降法和中心組合（Box-Behnken design，BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)或者中心合成設(shè)計(jì)（Central composite design，CCD）來獲取最佳培養(yǎng)基配比和發(fā)酵條件［11，26，32，35］。

2 內(nèi)生真菌多糖的提取、分離和純化

2.1 內(nèi)生真菌多糖的提取

目前，內(nèi)生真菌多糖的提取根據(jù)提取部位的不同存在一定差異。主要涉及胞外多糖、細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)多糖，其中細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)多糖可以通過配置不同酸堿度的水溶液，從細(xì)胞壁上提取不同類型的多糖。

對(duì)于胞外多糖，首先得通過離心或過濾將發(fā)酵液和菌絲分開，菌絲用蒸餾水進(jìn)行沖洗，以清除菌絲中的EPS［11，32］。為減少乙醇用量，發(fā)酵液需減壓蒸發(fā)濃縮［32］，隨后利用乙醇或異丙醇進(jìn)行沉淀，且在 4℃環(huán)境中靜置 12-24 h［8，26，32］，也可通過離心代替靜置，使沉淀快速分層［8］。

對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)多糖，提取方法相對(duì)劇烈。首先菌絲干燥后粉碎，有機(jī)試劑脫脂，隨后依據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)配制不同pH的水溶液進(jìn)行水提醇沉。如果需要同時(shí)提取菌絲水提多糖（Water-extracted mycelial polysaccharide，WPS），堿水提多糖（Sodium hydro-xide-extracted mycelial polysaccharide，SPS）和酸水提多糖（Hydrochloric-extracted mycelia polysaccharide，APS），通常以純水（pH約為7）為第一步，隨后再采用堿水（NaOH配置）或者酸水（HCl配置）進(jìn)行提取，且二者順序可變。但是需要注意的是純水提取多糖，溫度可高達(dá)100℃，而堿水或者酸水均易導(dǎo)致糖鏈水解，在采用堿或者酸水進(jìn)行提取時(shí)，溫度不宜太高，根據(jù)本課題組的經(jīng)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)參考，建議不要超過30℃。如Zhong等［36］對(duì)一株內(nèi)生真菌F. oxysporumFat9的菌絲多糖進(jìn)行提取時(shí)，預(yù)處理后加入20倍體積水，在90℃下浸提約90 min，離心收集上清液，采用醇沉即得水提多糖；殘?jiān)儆? mol/L NaOH溶液在室溫條件下提取24 h，離心取上清液進(jìn)行醇沉得堿提多糖；最后在用1 mol/L HCl在室溫條件下提取24 h，得酸提多糖，且3種多糖提取重量相近，均為7 g 左右。

由于內(nèi)生真菌菌絲多糖存在差異，在料液比、提取溫度、提取時(shí)間、酸堿度、提取次數(shù)上會(huì)有不同，為了提高提取效率，可采用單因素和響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化。例如，內(nèi)生真菌CSL-27的菌絲多糖提取過程中，通過單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4個(gè)關(guān)鍵影響因子，其影響大小順序?yàn)橐毫媳龋咀罱KpH＞醇沉?xí)r間＞醇沉溫度，最后通過響應(yīng)面優(yōu)化，確定最佳醇沉?xí)r間為16 h，醇沉溫度為37℃，pH為7.2，液料比為5∶1（L/L）［15］。利用響應(yīng)面法對(duì)內(nèi)生真菌F. oxysporumDzf17菌絲多糖WPS進(jìn)行提取條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，提取時(shí)間為1.7 h，提取溫度為95℃，料液比為 39∶1（V/W），重復(fù)提取一次的情況下，最終提取效率較之前提高 2 倍［37］。

2.2 內(nèi)生真菌多糖的分離純化

內(nèi)生真菌多糖的分離純化主要包含兩部分，第一是除去多糖中色素、蛋白質(zhì)、小分子物質(zhì)等雜質(zhì)；第二是利用分級(jí)醇沉、離子交換色譜或凝膠色譜進(jìn)行分離。通常，除蛋白質(zhì)的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、鹽酸脫蛋白法、三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA法）、酶法和等電點(diǎn)法等。除色素的方法包括活性炭吸附色素、H2O2氧化除色素、DEAE-纖維素法脫色素、堿性離子交換樹脂脫色素、膜分離技術(shù)（Membrane separation technipue，MST）和大孔吸附樹脂除色素。除去小分子物質(zhì)通常用半透膜透析法或纖維濾器透析法。除去淀粉常用淀粉酶法。為提高效率，PSEF可用胰蛋白酶或木瓜蛋白酶結(jié)合Sevag法除去蛋白［22］，用活性炭吸附、雙氧水氧化或大孔吸附樹脂除色素［6，23］，半透膜除小分子物質(zhì)［22］。其中，利用大孔吸附樹脂可同時(shí)除色素和除蛋白，而且其條件溫和、效率較高、操作相對(duì)簡(jiǎn)單，受到越來越多的歡迎［38］。在多糖分離步驟中，離子交換色譜和凝膠色譜仍是最常用的多糖分離純化方法，對(duì)收集到的餾分利用苯酚-硫酸法進(jìn)行檢視，以餾分管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，并根據(jù)曲線合并相同多糖，并且根據(jù)多糖峰形可初步判斷均一性［39］，也可利用高效液相凝膠柱色譜檢查多糖的均一性。

3 內(nèi)生真菌多糖的結(jié)構(gòu)特征研究

多糖由單糖組成，以糖苷鍵相連，形成線形或分支鏈狀大分子。通常研究多糖結(jié)構(gòu)主要涉及其一級(jí)結(jié)構(gòu)，包含糖苷鍵的組成、單糖殘基排列順序、相鄰單糖殘基連接方式、異頭碳構(gòu)型、分支狀態(tài)、有無蛋白質(zhì)或磷脂等結(jié)合物等。由于單糖種類較多，單糖殘基間存在多種連接方式，加上多糖鏈長(zhǎng)度、支鏈等不同，造成多糖種類非常豐富，也導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)解析相較于小分子化合物而言困難更大。大部分文獻(xiàn)僅對(duì)所得多糖的部分理化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究。如分離自內(nèi)生真菌C. globosumCGMCC 6882的多糖 GCP 由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸組成，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前僅表征了其部分理化性質(zhì)［40］。對(duì)于一些應(yīng)用較廣、結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單的多糖也能解析出其多糖鏈中的主要重復(fù)單元。例如，胡椒內(nèi)生真菌Diaporthesp.產(chǎn)多糖EPS-PD1主要由葡萄組成，經(jīng)過一系列波譜和化學(xué)分析，得出其為以（1→3）鍵連接的吡喃葡萄糖為主鏈，在O-6處被葡糖基取代的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元組成的多糖［16］。目前，多糖結(jié)構(gòu)描述主要涉及多糖的表觀特征、多糖平均分子量、單糖組成、單糖連接類型、單糖或者糖苷鍵的構(gòu)型、重復(fù)單元等方面。

3.1 紫外光譜（Ultraviolet spectrum，UV）和掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope，SEM）分析

分離純化后所得的均一多糖可利用紫外分光光度計(jì)200-400 nm紫外區(qū)間的吸光譜，觀察260和280 nm的波長(zhǎng)處是否存在吸收峰，有則說明樣品內(nèi)存在核酸或者蛋白等成分，沒有則表示多糖中無此類雜質(zhì)。多糖屬于大分子成分，不同多糖鏈所表現(xiàn)出的形態(tài)結(jié)構(gòu)具有一定的特征，可利用電子顯微鏡對(duì)多糖表明進(jìn)行觀察。例如，本課題組對(duì)瓦布貝母內(nèi)生真菌多糖進(jìn)行SEM分析，發(fā)現(xiàn)不同多糖表明特征存在顯著差異［19］。

3.2 多糖平均分子量（Relative average molecular weight，RMw）分析

均一多糖為多糖分子量在一定范圍，多糖鏈重復(fù)單元一致的混合糖鏈，表示相似鏈長(zhǎng)的平均分布。利用高效液相凝膠柱色譜或者普通的凝膠柱色譜對(duì)均一多糖分子量進(jìn)行分析時(shí)，所得到的分子量為其平均分子量的一個(gè)推算值。通常用多分散性（Mw/Mn）來評(píng)價(jià)多糖分子量分布的范圍。例如，分離自內(nèi)生真菌Chaetomiumsp. JY25的均一多糖通過凝膠滲透色譜法測(cè)得其平均分子量為1.961×104g/mol，多分散性值為1.838［14］。目前，常見多糖相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定方法有光散射法、超速離心沉降速度法、氣相滲透法、端基分析法、凝膠滲透色譜法和膜滲透法。其中高效凝膠滲透色譜法由于操作方便、無需有機(jī)溶劑、時(shí)間短、分離效果好等優(yōu)勢(shì)常被用作大分子多糖的分析，是目前最常用的一種相對(duì)分子量分析方法。其次是利用常壓的凝膠色譜對(duì)多糖進(jìn)行洗脫，根據(jù)洗脫曲線進(jìn)行相對(duì)分子量分析。以上兩種凝膠法均根據(jù)在相同體系條件下不同標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的分子量和保留時(shí)間之間的線性關(guān)系推算出未知樣品的平均分子量。

3.3 單糖組成分析

單糖種類、摩爾比等是研究多糖結(jié)構(gòu)信息的關(guān)鍵步驟。由于多糖以單糖殘基連成長(zhǎng)鏈，為分析單糖，首先需對(duì)長(zhǎng)鏈進(jìn)行水解。水解法包括完全酸水解法、部分酸水解法等。完全酸水解法:將多糖與強(qiáng)酸（硫酸、三氟乙酸）等試劑作用，在一定溫度下（80-100℃）將所有糖苷鍵等完全水解（4-10 h）。部分酸水解法:根據(jù)不同糖苷鍵穩(wěn)定不同，利用弱酸或低濃度的強(qiáng)酸在相對(duì)較溫和的條件下將較易斷裂的糖苷鍵進(jìn)行水解，然后利用柱色譜或分級(jí)沉淀等方法將水解后的多糖鏈分開，由于側(cè)鏈與主鏈相連的糖苷鍵較易斷裂，多糖部分酸水解后的醇析產(chǎn)物往往是多糖主鏈重復(fù)性結(jié)構(gòu)片段、糖醛酸鏈片段，從這些小片段可推測(cè)多糖鏈部分結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。水解后的多糖經(jīng)中和、過濾，可采用紙層析（Paper chromatography，PC）、薄層色譜（Thin layer chromatography，TLC）、氣相色譜（Gas chromatography，GC）、高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）、高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢（high performance anionexchange chromatography with pulsed ampero-metric detection，HPAEC-PAD）［8，14，18，26］等進(jìn)行分析。本課題組曾利用TLC法對(duì)川貝母內(nèi)生真菌Fusariumsp. A14 的胞外多糖A14EPS-1的主鏈和側(cè)鏈的單糖組成進(jìn)行了分析［22］，但是該法不能定量，無法得知相關(guān)單糖間的摩爾比例。GC法和HPLC法是目前比較常見的用于多糖的單糖組分分析的方法，均可實(shí)現(xiàn)定量分析，但是均需進(jìn)行衍生化。例如，本課題組對(duì)瓦布貝母內(nèi)生真菌6WBY3的胞外多糖6WBY3EPS-3 和 6WBY3EPS-4的單糖組分進(jìn)行分析時(shí)，首先利用PMP（l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone）進(jìn)行衍生化，然后利用HPLC對(duì)衍生化產(chǎn)物進(jìn)行分析，均獲得了其單糖組成和不同單糖間的摩爾比［19］，但是如果用質(zhì)譜（Mass spectrometry，MS）檢測(cè)器，示差檢測(cè)器或者蒸發(fā)光檢測(cè)器不用考慮衍生化的問題。Orlandelli等［34］利用HPAEC-PAD法，以CarboPac PA1柱（4×250 mm）為分析柱，以0.014 mol/L NaOH溶液流動(dòng)相，對(duì)內(nèi)生真菌Diaporthesp.JF766998胞外多糖的單糖組分進(jìn)行了分析，獲得了單糖組分及摩爾比。HPAEC-PAD法無需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理，流動(dòng)相無需使用有機(jī)試劑，但是該法中使用了鹽溶液，不可與質(zhì)譜等檢測(cè)器聯(lián)合使用。最后根據(jù)樣品峰面積和單糖標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和峰面積可計(jì)算求得單糖間摩爾比。

3.4 單糖結(jié)構(gòu)特征分析

通常，Smith降解、高碘酸氧化、甲基化反應(yīng)可分析多糖鏈中糖苷鍵連接位置。其中甲基化反應(yīng)應(yīng)用較多，它不僅可獲得多糖中單糖連接位點(diǎn)，還可根據(jù)不同甲基化單糖的比例，推測(cè)這種連接鍵型在多糖重復(fù)單元中所占比例。例如，對(duì)植物內(nèi)生真菌F.solaniSD5胞外均一多糖PS-1的甲基化分析得出該多糖具有L-鼠李糖基末端，（1→2）-L-鼠李吡喃糖基，（1→4）-D-鼠李吡喃糖基，（1→4，6）-D-鼠李吡喃糖基，其摩爾比接近1∶1∶3∶1［41］。

紅外光譜是定性鑒定多糖結(jié)構(gòu)的基本方法，由于靈敏度較高、所需多糖樣品量少、操作簡(jiǎn)單，已經(jīng)成為最常用的多糖結(jié)構(gòu)特征分析方法之一?？赏ㄟ^紅外區(qū)的特征吸收來鑒定多糖，如在3 600-3 200、3 000-2 800、1 700-1 500、1 400-1 200 和1 200-1 000 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰是多糖的特征吸收峰［42］；也可用于分析確定多糖中吡喃糖的糖苷鍵構(gòu)型，如對(duì)于葡聚糖來說，840 cm-1是α-吡喃糖苷鍵的特征吸收峰，890 cm-1是β-吡喃糖苷鍵的特征吸收峰；而810和870 cm-1是甘露糖的特征吸收峰。

3.5 核磁（Nuclear magnetic resonance，NMR）分析

NMR是解析化合物結(jié)構(gòu)最有效的手段，但多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使其在這一領(lǐng)域的應(yīng)用相對(duì)落后，近年來NMR技術(shù)有了較大發(fā)展后才得以提升。該技術(shù)可提供多糖的單糖組成、單糖殘基間的順序、單糖殘基糖苷鍵的位置和糖苷鍵的構(gòu)型等諸多信息，成為當(dāng)今分析多糖結(jié)構(gòu)不可缺少的方法。然而，由于多糖結(jié)構(gòu)自身的復(fù)雜性，許多多糖NMR信號(hào)相互重合，使得NMR的解析十分困難。對(duì)于一些由簡(jiǎn)單的重復(fù)單元組成的多糖，利用NMR技術(shù)已可做到迎刃而解。多糖在1H-NMR譜圖上的信號(hào)多集中在δ3.5-5.5 ppm范圍內(nèi)，H2-H6的質(zhì)子信號(hào)在δ3.5-4.5 ppm范圍內(nèi)，但疊加嚴(yán)重?zé)o法分辨，因此對(duì)于大多數(shù)多糖而言，1H-NMR的主要用途在于δ4.8-5.5 ppm范圍內(nèi)異頭質(zhì)子信號(hào)的解析及歸屬。一般情況下，α-構(gòu)型糖基異頭質(zhì)子的化學(xué)位移值超過5.0 ppm，而β-型糖基異頭質(zhì)子的信號(hào)小于5.0 ppm，憑此可將二者區(qū)分開。借助于異頭質(zhì)子在NMR上的峰面積之比可大體推測(cè)各種連接方式糖基在多糖中的摩爾比。此外，通過13C NMR和2D NMR可對(duì)多糖的一些重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。常見的二維譜有COSY、HSQC、HMBC、NOESY、TOCSY等。COSY主要分析氫氫近程相關(guān)，HSQC主要分析碳?xì)渲苯酉嚓P(guān)，HMBC主要分析碳?xì)溥h(yuǎn)程相關(guān)，NOESY主要分析氫氫空間相關(guān)，TOCSY主要分析氫氫全相關(guān)。例如，Zeng等［43］對(duì)內(nèi)生真菌F.solaniDO7多糖DY1和 DY2進(jìn)行NMR分析，并結(jié)合甲基化等結(jié)果，推導(dǎo)出 DY1中的糖苷鍵主要包括（1 →）-α-D-Glcp，（1 → 3）-β-L-Rhaf，（1 → 4）-β-DXylp，（1 → 6）-α-D-Glcp，（1 → 2，6）-α-D-Glcp和（1→2）-β-D-Galp；而DY2中的糖苷鍵主要是（1 →）-β-D-Glcp，（1 → 2）-α-L-Rhaf，（1 → 3）-α-LAraf，（1 → 4）-β-D-Glcp，（1 → 4，6）-β-D-Glcp 和（1 → 3）-α-D-Galp。

4 內(nèi)生真菌多糖的體外活性研究

4.1 抗腫瘤

腫瘤作為人類健康的一大殺手，利用PSEF來抑制腫瘤的研究相對(duì)于其它來源多糖而言較少，但從已有的報(bào)道中仍可以發(fā)現(xiàn)PSEF對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較好的生長(zhǎng)抑制作用，是值得進(jìn)一步關(guān)注的大分子天然產(chǎn)物。Li等［11］對(duì)從番石榴的內(nèi)生真菌Bionectria ochroleucaM21中分到的EPS進(jìn)行了抗腫瘤活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該EPS在濃度為0.025-1.6 mg/mL的范圍內(nèi)對(duì)人體肝癌HL-7702細(xì)胞系沒有抑制活性，但是在0.1-0.45 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞系，胃癌SGC-7901細(xì)胞系和結(jié)腸癌HT29細(xì)胞系有良好的抑制活性，并且隨濃度和處理時(shí)間的增加抑制活性增強(qiáng)。Wen等［44］對(duì)從藏紅花中分離到的內(nèi)生真菌Penicillium citreonigrumCSL-27的粗EPS的抗腫瘤活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)它對(duì)K562、A549、HL-60和HeLa細(xì)胞系均有良好的抑制增殖活性，而且具有明顯的劑量依賴，在濃度為10 mg/mL時(shí)，該多糖對(duì)K562、A549、HL-60和HeLa細(xì)胞系的增殖抑制率分別為46.16%、44.97%、44.95%和33.10%。Wang等［6］以甘油（GCP-1）和粗甘油（GCP-2）為輔助營(yíng)養(yǎng)成分，利用內(nèi)生真菌C. globosumCGMCC 6882進(jìn)行生物合成分別得到GCP-1和GCP-2兩個(gè)多糖樣品，活性研究發(fā)現(xiàn)該多糖對(duì)人類肺癌A549細(xì)胞系具有良好抑制活性。本課題組曾對(duì)川貝母內(nèi)生真菌Fusariumsp. A14的EPS進(jìn)行了系列分離純化并得到兩個(gè)均一多糖A14EPS-1和A14EPS-2，抗腫瘤細(xì)胞增殖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A14EPS-2表現(xiàn)出中等的抑制人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞系的活性［22］。相對(duì)小分子天然產(chǎn)物而言，多糖的抗腫瘤活性較弱，但是，由于PSEF產(chǎn)量比小分子化合物高數(shù)十倍，甚至上百倍，且毒性低，使得從內(nèi)生真菌中篩選和開發(fā)具有抗腫瘤活性的多糖具有重要的理論和實(shí)際意義。

4.2 抗氧化

氧自由基，又稱為活性氧（Reactive oxygen species，ROS），是普遍存在于人和動(dòng)植物體內(nèi)的代謝副產(chǎn)物［45］。過量的活性氧會(huì)引發(fā)細(xì)胞膜磷酸酯質(zhì)過氧化，蛋白質(zhì)氧化，核酸損傷和酶的失活，誘發(fā)細(xì)胞調(diào)亡等［46］，從而引起一系列疾病，如癌癥、不育癥、心臟病、阿爾茨海默病等，而且還會(huì)加速生物體衰老［47-49］。從自然界中尋找高效、安全低毒的抗氧化劑就顯得十分重要。研究表明，PSEF具有廣泛的抗氧化活性，是一類極其重要的抗氧化劑來源。Chen等［8］對(duì)一株紅樹林內(nèi)生真菌Aspergillussp. Y16的EPS研究，得到均一多糖成分As1-1，其具有良好的二苯基苦酰肼基（1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和超氧自由基清除能力。Li等［4］對(duì)從盾葉薯蕷內(nèi)生真菌F. oxysporiumDzf17代謝產(chǎn)物中得到的EPS、水提取菌絲多糖（WPS）和氫氧化鈉提取的菌絲體多糖（SPS）的抗氧化測(cè)定發(fā)現(xiàn)，SPS多糖抗氧化活性最強(qiáng)，其DPPH自由基清除活性EC50為63.37μg/mL，亞鐵離子螯合活性EC50為44.91 μg/mL。Mahapatra 和 Banerjee［21］對(duì)一株從糖膠樹Alstonia scholaris分到的內(nèi)生真菌F. solaniSD5的均一胞外多糖成分PS-I的抗氧化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該多糖具有較強(qiáng)清除DPPH自由基的活性，而且安全無毒，是一種潛在的無毒外源抗氧化劑。本課題組對(duì)川貝母內(nèi)生真菌A14的兩個(gè)均一胞外多糖A14EPS-1和A14EPS-2抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，其均表現(xiàn)出對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除活性［22］。Wang等［50］發(fā)現(xiàn)分離自當(dāng)歸的內(nèi)生真菌Alternaria tenuissimaF1的EPS表現(xiàn)出較強(qiáng)超氧陰離子和羥基自由基清除活性，而且還具有良好的還原活性。此外，本課題組研究了多株分離自瓦布貝母的內(nèi)生真菌的EPS發(fā)現(xiàn)，其均具有一定的清除自由基等抗氧化活性［19，39］。綜上可見，植物內(nèi)生真菌多糖的抗氧化活性普遍存在，這不僅有助于PSEF在醫(yī)藥和食品保健品等領(lǐng)域的開發(fā)與利用，而且，自由基或活性氧在植物體內(nèi)表現(xiàn)出廣泛的生理生化作用，探索該類多糖抗氧化能力在與植物共生過程中所起作用的研究也非常有意義。

4.3 抗菌

Wang等［40］研究發(fā)現(xiàn)，分離自中藥植物絞股藍(lán)的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生抗菌活性多糖，通過分離純化得到均一多糖GCP，其通過破壞內(nèi)膜和增加細(xì)胞滲透性發(fā)揮抗菌活性，但對(duì)細(xì)胞壁沒有影響，該多糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為1.75和0.67 mg/mL。Zeng等［20，43］從來源于鐵皮石斛莖中內(nèi)生真菌F. solaniDO7發(fā)酵產(chǎn)物中分離到兩個(gè)多糖DY1和DY2，均表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌活性，特別是對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有很強(qiáng)的抑制活性。但是本課題組對(duì)多株川貝母內(nèi)生真菌多糖進(jìn)行了抗菌研究，未發(fā)現(xiàn)其多糖有抗菌作用，說明并非所有多糖都具有此類活性。

4.4 其它活性

除上述生物活性外，研究還發(fā)現(xiàn)PSEF還具有抗炎、抗過敏、免疫增強(qiáng)、益生元等生物活性。Mahapatra和Banerjee研究了內(nèi)生真菌F. solaniSD5均一胞外多糖PS-I在不同劑量飼養(yǎng)大鼠30 d后腸（糞）細(xì)菌的濃度，與對(duì)照相比，發(fā)現(xiàn)可顯著降低Clostridium perfringens的濃度［32］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)多糖PS-1在劑量濃度為10、100和1 000 μg/mL時(shí)，膜穩(wěn)定化的百分比分別為27.46±4.22%、45.08±2.80%和55.05±5.68%，二者間呈顯著相關(guān)性，且多糖PS-1活性與標(biāo)準(zhǔn)藥物吲哚美辛相當(dāng)，可見PS-I可保護(hù)細(xì)胞膜免受有毒物質(zhì)的影響，并通過抑制炎癥介質(zhì)形成來干擾早期炎癥反應(yīng)；對(duì)體外大鼠腸系膜肥大細(xì)胞保護(hù)研究表明，與對(duì)照相比，化合物48/80在劑量濃度為4 μg/mL時(shí)使肥大細(xì)胞發(fā)生脫離，而多糖PS-1可以抑制化合物48/80介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫離，并表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。因?yàn)榛衔?8/80是肥大細(xì)胞中強(qiáng)有力的組胺釋放劑，多糖PS-1具有顯著的肥大細(xì)胞穩(wěn)定活性，從而間接抑制了組胺釋放，表現(xiàn)抗過敏活性［41］。Li等［24］對(duì)藏紅花內(nèi)生真菌P. citreonigrumCSL-27的粗胞外多糖進(jìn)行了分離純化，得到一個(gè)均一水溶性胞外多糖EPS-2，發(fā)現(xiàn)該多糖顯著減弱慶大霉素誘導(dǎo)的HEIOC1細(xì)胞損傷，增加斑馬魚細(xì)胞的存活率，顯示出保護(hù)耳蝸毛細(xì)胞免受毒性物質(zhì)侵害的活性。Zeng等［20］對(duì)鐵皮石斛內(nèi)生真菌F. solaniDO7產(chǎn)生的兩個(gè)多糖DY1和DY2活性研究發(fā)現(xiàn)，DG2對(duì)人胚腎細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒作用，還可增加TNF-α、IL-6和iNOs mRNA的表達(dá)，而這可進(jìn)一步促進(jìn)RAW264.7中TNF-α、IL-6和NO的產(chǎn)生，可見DG2具有強(qiáng)大的免疫活性。

5 內(nèi)生真菌多糖與宿主植物間的作用

植物為其內(nèi)生真菌提供營(yíng)養(yǎng)和生活場(chǎng)所，同樣部分內(nèi)生真菌也能幫助宿主植物抵抗逆境，甚至影響宿主植物的生長(zhǎng)發(fā)育［51］。越來越多的研究表明PSEF不僅具有廣泛的體外生理活性，而且還能夠刺激宿主或非宿主植物某些化合物的產(chǎn)生或者產(chǎn)量的增加。例如，Li等［52］研究了內(nèi)生真菌Dzf12的EPS、WPS和NaOH提的SPS以及通過水解作用分別得到 EOS（EPS-derived oligosaccharide）、WOS（WPS-derived oligosaccharide） 和 SOS（SPS-derived oligosaccharide）3種低聚糖共6種糖對(duì)盾葉薯蕷無菌苗和盾葉薯蕷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)合成薯蕷皂苷元的影響，發(fā)現(xiàn)其均可提高薯蕷皂苷元產(chǎn)量，但是受多糖濃度影響明顯，其中濃度為20 mg/mL的EOS可使細(xì)胞合成的薯蕷皂苷元產(chǎn)量提高6.88倍。同樣，從盾葉薯蕷中分離得到的另外一株內(nèi)生真菌F.oxysporiumDzf17的EPS、WPS和NaOH提的SPS也均有提高盾葉薯蕷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)薯蕷皂苷元的產(chǎn)量，其中以水提多糖的促進(jìn)作用最強(qiáng)［17］。丹參根部?jī)?nèi)生真菌Trichoderma atrovirideD16不僅本身可以產(chǎn)生丹參酮I（T-I）和丹參酮IIA［29］，而且該菌株多糖可刺激其宿主植物丹參毛狀根的生長(zhǎng)和宿主植物細(xì)胞丹參酮I（T-I）和丹參酮IIA的生物合成［28］。從苦蕎分離得到的一株內(nèi)生真菌F. oxysporumFat9菌絲多糖和EPS也均可刺激宿主植物黃酮類產(chǎn)物的積累，同時(shí)提高苦蕎麥提取物的抗氧化活性［36］。內(nèi)生真菌Gilmaniellasp. AL12可刺激Atractylodes lancea產(chǎn)生揮發(fā)油，深入研究發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)生的甘露聚糖有助于該菌株和A. lancea之間形成拮抗平衡，甘露聚糖的一部分被降解為甘露糖以進(jìn)行己糖激酶活化，促進(jìn)光合作用和能量代謝，潛在的代謝通量流向萜類生物合成；另一部分通過G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和甘露聚糖結(jié)合凝集素途徑直接增強(qiáng)了A. lancea的自身免疫，在隨后的防御反應(yīng)中促進(jìn)了揮發(fā)油的積累［23］?？梢?，內(nèi)生真菌多糖成分在其與宿主植物相互作用的過程中扮演了重要作用。

6 展望

內(nèi)生真菌是一類極其重要的微生物資源，具有非常豐富的生物多樣性，而且每種內(nèi)生真菌均具有產(chǎn)多糖能力，也使得內(nèi)生真菌產(chǎn)生的多糖具有廣泛的多樣性。目前，大型真菌多糖的研究相對(duì)較多，部分多糖結(jié)構(gòu)也基本明確，而且由于多種大型真菌本身就作為食物長(zhǎng)期使用，開發(fā)出的大型真菌多糖產(chǎn)品（如香菇多糖片等）市場(chǎng)接受度好。自1993年，Stierle等［53］從內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)紫杉醇的菌株開始，內(nèi)生真菌才廣泛的引起人們的注意。而內(nèi)生菌多糖的研究只有幾十年的歷史，研究還相對(duì)落后。例如，內(nèi)生真菌據(jù)推測(cè)有100萬種左右［54］，但到目前為止，根據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)分離得到的內(nèi)生真菌均一多糖不足40個(gè)（表1）。關(guān)于多糖結(jié)構(gòu)、活性、工業(yè)化生產(chǎn)、產(chǎn)品開發(fā)等方面內(nèi)生真菌還遠(yuǎn)不如大型食用真菌。但是，在大型真菌上的研究成果可以為內(nèi)生真菌多糖的開發(fā)提供借鑒。而且，大型真菌主要屬于擔(dān)子菌亞門，少數(shù)屬于子囊菌亞門，國(guó)內(nèi)報(bào)道的食用菌不到100種，有藥用價(jià)值的真菌僅有30多種［55］，大型食用真菌多糖主鏈主要為葡聚糖和甘露聚糖［56］，而植物內(nèi)生真菌無論在生物多樣性上還是在其多糖類型上都遠(yuǎn)多于大型真菌。同樣PSEF和其它類型真菌多糖一樣，也具有廣泛的生理活性，表現(xiàn)出極大的開發(fā)價(jià)值。加強(qiáng)對(duì)內(nèi)生真菌多糖的研究，有助于內(nèi)生真菌多糖產(chǎn)物的開發(fā)利用。

內(nèi)生真菌可以與植物和諧共存，而多糖作為內(nèi)生真菌產(chǎn)量較大的天然產(chǎn)物之一，對(duì)植物和內(nèi)生真菌間相互作用產(chǎn)生重要影響，加之多糖所具有的多重生理功能，如信號(hào)調(diào)節(jié)、免疫增加、滲透壓調(diào)節(jié)等，使得以PSEF為化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)來探討植物與內(nèi)生真菌間相互作用的機(jī)制具有重要意義。目前，此類研究較少，僅有通過體外獲得PSEF，然后將其作為植物或植物細(xì)胞等培養(yǎng)的添加劑，以促使植物或植物細(xì)胞增加抗逆活性，刺激特定化合物產(chǎn)量提高。加強(qiáng)植物內(nèi)生真菌多糖在內(nèi)生真菌與宿主植物間相互作用中所扮演角色的研究，不僅有助于理解內(nèi)生真菌如何避免植物免疫體系的作用又不對(duì)植物造成損害，而且還有助于利用多糖產(chǎn)物間接影響宿主植物生長(zhǎng)發(fā)育。

內(nèi)生真菌在脫離原來的生活環(huán)境后，在反復(fù)的純培養(yǎng)過程中，會(huì)發(fā)生菌株的退化，這會(huì)導(dǎo)致內(nèi)生真菌代謝發(fā)生改變。例如，從平貝母中分離到的內(nèi)生真菌P7在反復(fù)培養(yǎng)后其產(chǎn)生物堿的能力就大大下降［57］。但是至今未見研究?jī)?nèi)生真菌在退化過程中其產(chǎn)多糖能力改變的相關(guān)報(bào)道。此外，盡管內(nèi)生真菌可產(chǎn)生豐富的多糖，但是目前仍缺少將其投入到工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)例，加強(qiáng)對(duì)其開發(fā)力度也很有必要。

總之，目前關(guān)于PSEF研究尚處于起步階段，以內(nèi)生真菌為出發(fā)點(diǎn)，研究其多糖結(jié)構(gòu)、生物學(xué)、生理生化等方面的功能正在成為內(nèi)生真菌研究的一個(gè)熱點(diǎn)，也必將取得豐碩成果。