陳橋 吳海英 王宗壽 謝雨康 李宜青 孫俊松，3

（1. 中國科學(xué)院上海高等研究院，上海 201210；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 上?？萍即髮W(xué)，上海 201210；4. 福建省南平市畜牧站，南平 353000）

全世界已經(jīng)生產(chǎn)和消費了上億噸塑料產(chǎn)品［1］。由于塑料垃圾不能自然降解而日積月累，對地球造成越來越大的生態(tài)危機［2］。隨著公眾對環(huán)境惡化和資源消耗的日益關(guān)注，近年來利用生物技術(shù)生產(chǎn)可降解聚合物替代制品受到了廣泛關(guān)注［3］。

聚羥基脂肪酸（Polyhydroxyalkanoates，PHAs）是一些微生物在營養(yǎng)不均衡的條件下生長時，在胞內(nèi)合成的高分子聚合物［4］，作為胞內(nèi)能量儲存物［5］。PHAs的物理性質(zhì)會因其化學(xué)組成和重復(fù)單元數(shù)量不同而各不相同［6］。聚3-羥基丁酸酯（Poly-3-hydroxybutyrate，PHB）是自然界最常見的 PHAs［7］。文獻報道，將來自羅氏真養(yǎng)菌產(chǎn)PHB的操縱子phaCAB外源表達到大腸桿菌，重組大腸桿菌可以合成PHB。同樣，在釀酒酵母和蠟狀芽孢桿菌也實現(xiàn)了PHB的異源合成［8］。

羅氏真養(yǎng)菌中PHB的合成途徑是從乙酰輔酶A開始，經(jīng)phaA編碼的β-酮基酯酞輔酶A硫解酶催化兩個乙酰輔酶A產(chǎn)生乙酰乙酰輔酶A；再由phaB編碼依賴于NADPH的乙酰乙酰輔酶A還原酶，催化乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為羥基丁酰輔酶A；最后由聚羥基脂肪酸聚合酶（phaC）將羥基丁酰輔酶A單體聚合形成PHB。盡管重組大腸桿菌PHB發(fā)酵生產(chǎn)的水平已大幅提升，但與石油工業(yè)的衍生聚合物相比，PHB的微生物生產(chǎn)仍面臨成本高的問題。因此，一些研究策略，如優(yōu)化發(fā)酵工藝、使用農(nóng)業(yè)廢棄物等廉價碳源［9］及進一步改造生產(chǎn)菌株仍然十分必要。在菌株的改造中，除了需要敲除副產(chǎn)物生成的競爭途徑，優(yōu)化碳源代謝流及乙酰輔酶A的分配，增加還原力輔因子NADPH的供給也顯著影響PHB的合成效率［10］。

此外，增加細胞密度也是提高PHB生物合成量的有效手段。研究發(fā)現(xiàn)，影響細胞密度的重要因素之一是發(fā)酵液中積累大量的有機酸，而其產(chǎn)生與pH值和培養(yǎng)基的組成成分相關(guān)。當培養(yǎng)基中碳源濃度高于生長需求時，富余碳源不被充分氧化產(chǎn)生二氧化碳，此部分碳代謝流會走向有機酸的合成，其中主要包括乙酸［11］。大腸桿菌在營養(yǎng)均衡的培養(yǎng)基以及微酸性發(fā)酵條件（pH 6.0-7.0）下產(chǎn)乙酸濃度較低，此條件下有利于細胞密度的增加。其他相關(guān)條件，尤其是碳源濃度直接影響大腸桿菌碳代謝途徑的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。例如，在大腸桿菌JM109中，高濃度的葡萄糖會抑制丙酮酸脫氫復(fù)合體參與其分解物丙酮酸的進一步氧化，轉(zhuǎn)而利用丙酮酸氧化酶（poxB）途徑脫羧生成乙酸［12］。細胞內(nèi)的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，如Cra、Crp和ArcA，也被證明與碳代謝和細胞密度有關(guān)［13］。

目前研究發(fā)現(xiàn)，各亞種的大腸桿菌菌株均可用于PHB的生產(chǎn)，但即使使用完全相同的表達策略，某些菌株仍表現(xiàn)出相對較高的PHB產(chǎn)量。此前我們獲得了一株大腸桿菌S17-3，它是模型菌株S17-1的實驗室自發(fā)突變株。在富含碳源的培養(yǎng)基中，表達phaCAB的S17-3轉(zhuǎn)化子比其他大腸桿菌具有更好的生長性能［14］。針對大腸桿菌在PHB合成中展現(xiàn)的碳源利用率的提升，以及高密度培養(yǎng)的特異表型，十分有必要對該突變株進行深一步的研究，本研究借助全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序分析等手段，發(fā)現(xiàn)了葡萄糖代謝通路中的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（pgi）和6-磷酸葡萄糖脫氫酶（zwf）基因?qū)τ赟17-3的高密度生長性能和PHB生產(chǎn)起著重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株、質(zhì)粒信息以及PCR 所用的模板及引物序列等信息如表1 所列，大腸桿菌S17-3為實驗室保存的實驗菌株；全基因組掃描測序及比對分析，上海美吉生物公司；轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序及數(shù)據(jù)初步統(tǒng)計，生工生物工程（上海）股份有限公司；基因組DNA提取試劑盒、PCR清潔試劑盒、質(zhì)粒小劑量提取試劑盒等，杭州愛思進生物技術(shù)有限公司；Taq DNA聚合酶，康為世紀生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶BamH I 和XhoI，賽默飛世爾科技公司；Phanta高保真DNA聚合酶、一步克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司。S1000TMPCR擴增儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限責任公司；Tanon EPS30電泳槽及Gel DocTM XR+全自動凝膠成像儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限責任公司；NANODROP 2000c微量分光光度計，賽默飛世爾科技公司；高速冷凍離心機，艾本德生命科學(xué)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱及恒溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司。

表1 菌株，質(zhì)粒和引物

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 大腸桿菌的搖瓶培養(yǎng)均使用LB培養(yǎng)基:10 g/L 氯化鈉，10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L酵母浸取物；發(fā)酵產(chǎn)PHB的培養(yǎng)基為添加了20 g/L葡萄糖，20 g/L乳糖，20 g/L甘油的LB培養(yǎng)基。在實驗需要時，添加的氨芐青霉素（Amp）濃度為100 μg/mL。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 以引物對CAB-F和CAB-R進行高保真PCR得到目標phya-CAB表達載體（引物序列見表1），將得到的PCR產(chǎn)物進行清潔并測定濃度。用BamH I和XhoI快切酶將質(zhì)粒pBluescript II SK（+）線性化，在37℃中反應(yīng)2 h后進行清潔并測定濃度。將清潔后的質(zhì)粒和片段通過一步克隆試劑盒進行連接，之后立即進行轉(zhuǎn)化。

1.2.3 大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)方法 從大腸桿菌LB平板上挑取單克隆到3 mL的液體LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。按1%的接種量轉(zhuǎn)接到盛有50 mL培養(yǎng)基的500 mL三角燒瓶里，置于37℃，200 r/min的恒溫搖床培養(yǎng)，3-4 h待OD600到0.5-0.6左右，取出置于冰上預(yù)冷。于此同時，將電轉(zhuǎn)杯，冷凍離心機，無菌水，無菌EP管也都預(yù)冷上。將預(yù)冷好的菌液放入預(yù)冷的冷凍離心機（4℃）中，5 500 r/min，7 min，去上清，留下菌體。用預(yù)冷的無菌水洗滌菌體3次后，用300 μL無菌水打勻菌體，分裝到預(yù)冷的1.5 mL EP 管中。轉(zhuǎn)化操作時，將2.0 μL DNA片段加入100 μL 感受態(tài)細胞中，混勻后冰浴10 min。設(shè)置電轉(zhuǎn)電壓為2.5 KV，空擊時間為6.0 ms。電轉(zhuǎn)操作后，加入700 μL 37℃的 LB培養(yǎng)基復(fù)蘇，置于37℃恒溫搖床，1 h。獲得轉(zhuǎn)化子后，挑取單菌落進行PCR驗證，引物來自所構(gòu)建質(zhì)粒的同源片段［15］。

1.2.4 大腸桿菌基因敲除方法 本研究使用了Red的同源重組方法進行基因敲除。Red重組系統(tǒng)由3個基因編碼，分別是exo，bet和gam。Exo是5'-3'核酸外切酶，可以作用于雙鏈DNA，Bet是單鏈DNA結(jié)合蛋白，Gam抑制RecBCD核酸外切酶的活性。在大腸桿菌（Escherichia coli）以及釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）中，Red重組酶可以使同源序列長只有35 bp的DNA片段與細菌的染色體發(fā)生同源重組，從而實現(xiàn)對細菌的定點改造。Red重組通常會在染色體基因上留下抗性標記基因，抗性標記基因的存在有可能會影響其生物學(xué)功能。利用FLP/FRT系統(tǒng)可以有效的解決該問題。本研究中使用的是帶有Red基因的質(zhì)粒pKD46以及帶有flp的重組酶的質(zhì)粒pCP20。為了提高敲除效率，本研究使用的同源臂為300 bp，通過overlap PCR方法得到帶有同源臂及抗性篩選基因的敲除片段。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵實驗 將轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的S17-3菌株轉(zhuǎn)接入搖瓶進行發(fā)酵。首先在平板上挑取單克隆，轉(zhuǎn)接到3 mL帶有氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)8-12 h，再將500 μL培養(yǎng)液接入裝有50 mL LB的500 mL搖瓶中（1%的接種量）。將已滅菌的葡萄糖、乳糖或甘油分別加入LB培養(yǎng)基，使各自的終濃度達到20 g/L。置于37度搖床培養(yǎng)，24 h，200 r/min。

1.2.6 全基因組掃描測序及比對分析 菌株S17-3全基因組掃描測序采用的是Illumina PE測序。測序工作由上海美吉生物公司完成。對測序所得到的基因組序列進行SNP（單核苷酸多態(tài)性）和Indel（插入缺失突變）分析。BW25113在線基因組信息網(wǎng)址 為:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/NZ_CP009273?report= genbank&log$=nuclalign&blast_rank=4&RID=4PSGBGX501R

1.2.7 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序及比對分析 總RNA的提取:按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書進行提取。隨后進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序上機前樣品準備，流程:（1）rRNA去除:使用試劑盒Ribo-off rRNA Depletion Kit，具體操作步驟簡寫如下:a. 準備總RNA樣品；b. RNA樣品與探針雜交；c. RNase H消化；d. DNase I 消化；e. rRNA-depleted RNA 純化。（2）IncRNA 文庫構(gòu)建:使用試劑盒VAHTSTM Stranded mRNA-seq Library Prep Kit for illumina?，具有的操作步驟簡寫如下:a. IncRNA片段化；b. 雙鏈cDNA合成；c. 末端dA-Tailing；d.接頭連接；e. 連接產(chǎn)物純化與片段大小分選；f. 文庫擴增。（3）文庫質(zhì)檢:使用8%的PAGE膠電泳檢測。（4）定量混合:為了方便等量混合便于上機檢測，對回收的DNA進行精準定量，使用的是Qubit2.0 DNA 檢測試劑盒。轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序由上海生工生物有限公司完成，并對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行基因差異表達分析。

2 結(jié)果

2.1 不同碳源條件下的大腸桿菌高密度生長

大腸桿菌在正常的搖瓶發(fā)酵條件下，其培養(yǎng)液最終的OD600一般約為5-10。本研究中的大腸桿菌突變菌株S17-3在含有表達質(zhì)粒pBhya-CAB（S173-H）時，可以在不同碳源的LB培養(yǎng)基中表現(xiàn)出高密度生長的特性，而含有pBhya-CAB的模式菌株BW25113的轉(zhuǎn)化株（BW25113-H）并未表現(xiàn)出同樣的生長特性。作為對照，S17-3和BW25113同時表達了不含phaCAB操縱子的空載質(zhì)粒pBluescript II SK（+）（S173-P）。如圖 1所示，S17-3在表達pBhya-CAB且發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同碳源時，葡萄糖（Glu）作為碳源的OD600最高，可達40左右，乳糖（Lac）和甘油（Gly）作為替代碳源，其培養(yǎng)液的最高OD600也達到35左右。而對照菌株，含有空載質(zhì)粒pBluescript II SK（+）的S17-3轉(zhuǎn)化株，及其它相應(yīng)的對照株，其最高OD600均低于10。

圖1 大腸桿菌各菌株的生長密度的測量

2.2 全基因組掃描測序及轉(zhuǎn)錄組測序分析

為了揭示大腸桿菌菌株S17-3在表達質(zhì)粒pBhya-CAB表現(xiàn)出高密度生長特性的機理。本研究將S17-3全基因組掃描測序后同BW25113比對分析，發(fā)現(xiàn)兩株菌的遺傳差異較大，它們在碳代謝、糖的轉(zhuǎn)運和轉(zhuǎn)錄等重要功能基因上存在序列差異，如pgi、cyaA等，pgi是編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，催化6P-葡萄糖合成6P-果糖，參與糖酵解代謝以及參與可拉酸的其中一種單糖巖藻糖的合成；cyaA編碼腺苷酸環(huán)化酶，在碳代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，總結(jié)如表2所示。其中，S17-3中的基因pgi發(fā)生了點突變，722位的堿基C變成了T，造成非同義突變（堿基的改變影響氨基酸的表達），丙氨酸（GCG編碼）突變成了纈氨酸（GTG編碼）。另外，點突變的基因還包括調(diào)控蛋白GalB，半乳糖磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中的GatB；而存在移框突變的蛋白有TtdB（酒石酸脫水酶β亞基）、GalR（LacI 家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白）等，但是對上述基因進行缺失操作后，并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的遺傳性狀改變（數(shù)據(jù)未顯）。

此外，本研究對兩種培養(yǎng)方式下獲得的細胞進行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序及比對分析，分別是菌株S17-3/pBhya-CAB（發(fā)酵加葡萄糖）（記為S173-H），S17-3/pBluescript II SK（+）（發(fā)酵加葡萄糖）（記為S173-P），進行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序，每個樣品2個平行。測序報告及比對分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的基因所編碼的蛋白主要參與糖的轉(zhuǎn)運，應(yīng)激反應(yīng)以及與氨基酸合成相關(guān)的代謝途徑，下調(diào)部分的基因主要編碼一些糖苷轉(zhuǎn)移酶或轉(zhuǎn)運蛋白，總結(jié)如圖2所示。據(jù)文獻報道，PHB的合成需要消耗大量的輔酶因子NADPH，而NADPH細胞內(nèi)的主要來源之一是戊糖磷酸途徑?；騴wf是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，編碼6P-葡萄糖脫氫酶，催化6P-葡萄糖合成6P-葡萄酸內(nèi)脂，因此考察Zwf的表達量可以用來預(yù)測PPP途徑的代謝流量。

表2 全基因組掃描測序及比對分析

圖2 轉(zhuǎn)錄組測序分析

2.3 突變菌株的生長曲線

為了研究基因Pgi突變帶來的影響，在菌株S17-3和BW25113中，利用Red同源重組系統(tǒng)敲除基因pgi，得到突變菌株S17-3/Δpgi和BW25113/Δpgi。在相同的培養(yǎng)條件下發(fā)酵菌株BW25113，S17-3，BW25113/Δpgi和 S17-3/Δpgi。實驗結(jié)果如圖 3-A所示，S17-3敲除Pgi的菌株生長變得遲緩，但其最大OD600值和野生型沒有顯著差異。BW25113敲除Pgi的菌株生長得到改善，其最大OD600值（約9.0）也優(yōu)于野生型（約5.0）。同樣，在上述的培養(yǎng)條件下發(fā)酵菌株 S17-3/Δpgi/pBhya-CAB（S173/Δpgi-H），S17-3/pBhya-CAB（S173-H），BW25113/Δpgi/pBhya-CAB（BW25113/Δpgi-H）以及 BW25113/pBhya-CAB（BW25113-H）。實驗結(jié)果如圖3-B所示，S173/Δpgi-H相比S173-H同樣生長變得遲緩，但其最大OD600值沒有顯著差異。而BW25113/Δpgi-H相比于BW25113-H的生長性能有明顯提升，最大OD600值為15左右。

為了研究Zwf對S17-3高密度生長的影響，在S17-3和BW25113中分別敲除zwf，得到突變菌株S17-3/Δzwf和 BW25113/Δzwf。在上述的培養(yǎng)條件下發(fā) 酵 菌 株 S17-3/Δzwf，BW25113/Δzwf，S17-3/Δzwf/pBhya-CAB（S173/Δzwf-H） 和 BW25113/Δzwf/pBhya-CAB（S173/Δzwf-H）。 實 驗 結(jié) 果 如 圖 3-C 所 示，S173/Δzwf-H的生長受到影響，最大OD600值約為20.0，其他敲除zwf的菌株最大OD600值與野生型無顯著差異。

3 討論

隨著地球資源日益減少，利用微生物發(fā)酵技術(shù)替代化學(xué)資源生產(chǎn)大宗化學(xué)品及可降解材料是研究的熱門和重點之一。微生物的高密度生長對發(fā)酵產(chǎn)物的提高往往至關(guān)重要，而微生物通常會通過其復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對細胞生長密度進行微妙而精確的調(diào)控，在不進行發(fā)酵干預(yù)的情況下，其最終培養(yǎng)密度往往不是很高。在本研究中，我們通過在一株大腸桿菌突變菌株S17-3中表達質(zhì)粒pBhya-CAB，獲得了高密度生長的重組大腸桿菌。借助全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序和比對分析，發(fā)現(xiàn)pgi有基因突變和轉(zhuǎn)錄水平的改變，zwf則在轉(zhuǎn)錄水平上有改變。在S17-3和BW25113中分別敲除pgi和zwf，結(jié)果顯示S17-3敲除pgi后，菌株生長會變得緩慢，但最大OD600值無顯著差異；BW25113敲除pgi后，菌株的生長性能得到改善，表達pBhya-CAB時最大OD600值較之前提升了約3倍。S17-3敲除zwf后，菌株生長性能受到影響，表達pBhya-CAB時最大OD600值降低了約1倍。BW25113敲除zwf后，菌株生長變緩慢，但最大OD600值無明顯差異。

圖3 大腸桿菌敲除Pgi和Zwf的生長曲線

研究發(fā)現(xiàn)，如圖4的代謝示意圖所示，pgi的敲除能提高菌體內(nèi)的磷酸戊糖途徑（Pentose phosphate pathway），導(dǎo)致細胞內(nèi)的輔酶NADPH濃度上升，而在PHB的生物合成過程中，PhaB催化需要消耗大量輔酶NADPH，從而可以提升乙酰CoA合成PHB的碳代謝支流，解釋了研究中發(fā)現(xiàn)的敲除pgi且同時表達PHB基因時，菌株為何能高密度生長，同時高水平表達PHB的生理現(xiàn)象［16］。此外，之前的研究發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)化株產(chǎn)乙酸水平低，也可能是由于乙酰CoA積累變少造成的。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，基因zwf的敲除不利于大腸桿菌轉(zhuǎn)化株在高碳源培養(yǎng)基中的高密度生長（相比S17-3-H），這應(yīng)該是由于，該突變會阻斷磷酸戊糖途徑，降低細胞內(nèi)的輔酶NADPH［17］，形成與pgi突變相反的代謝效果（代謝路徑如圖4所示）。

4 結(jié)論

通過在大腸桿菌中表達質(zhì)粒pBhya-CAB，本研究獲得了一株高密度生長的重組大腸桿菌菌株，無發(fā)酵調(diào)控情況下，培養(yǎng)液的最大OD600值可達到40左右。借助全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序和比對分析，發(fā)現(xiàn)菌株S17-3的pgi有基因突變和轉(zhuǎn)錄水平的改變，zwf有轉(zhuǎn)錄水平的改變。在S17-3和BW25113中分別敲除pgi和zwf后，大腸桿菌在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)出細胞密度的改變，提示S17-3的碳代謝流的分配調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與其他大腸桿菌菌株有明顯不同，需要進一步深入的研究。

圖4 本研究中所涉及大腸桿菌的相關(guān)碳代謝流走向圖