米粱波 曾偉主 黃科學 王得明 堵國成 周景文 陳堅

（1. 江南大學生物工程學院，無錫 214122；2. 齊魯制藥（內(nèi)蒙古）有限公司，呼和浩特 010080）

桿菌肽是一種由枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的多肽類廣譜抗生素，由多種環(huán)狀同系物組成，包括桿菌肽A、B1、B2、B3、C1、C2、C3和F，其中桿菌肽A和B占有95%抗菌活性［1］。桿菌肽A易轉變成無抗菌活性的桿菌肽F，且桿菌肽F具有腎毒性［2］。在實際生產(chǎn)過程中，為避免桿菌肽A的降解，通常在發(fā)酵終點添加Zn2+等二價金屬離子，將桿菌肽轉變成抗菌活性更強和更穩(wěn)定的“金屬-肽”螯合物［3］。桿菌肽對革蘭氏陽性和部分革蘭氏陰性細菌都具有強的抑菌活性，且對人和動物都沒有致病性，因而廣泛應用在臨床醫(yī)學和作為常用的動物飼料添加劑［4］。

桿菌肽的生產(chǎn)是一個復雜的生物轉化過程，一般利用基因工程技術，通過理性改造提高桿菌肽產(chǎn)量的做法比較困難。目前工業(yè)上提高桿菌肽生產(chǎn)的方法主要集中在發(fā)酵優(yōu)化和誘變選育。例如，采用正交試驗和Box-Behnken響應面法對桿菌肽發(fā)酵培養(yǎng)基中主要原料豆粕粉或麩皮的添加量進行優(yōu)化［5-6］。在此基礎上，通過控制變量的方式優(yōu)化桿菌肽發(fā)酵的溫度、溶氧和pH以獲得最佳發(fā)酵條件［7-8］。而應用傳統(tǒng)誘變選育的方式，篩選到桿菌肽產(chǎn)量比對照提高的突變菌株，為桿菌肽的工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎［9］。然而，隨著桿菌肽生產(chǎn)工業(yè)化進度的深入，使利用發(fā)酵優(yōu)化和傳統(tǒng)誘變選育提高桿菌肽產(chǎn)量的選擇更加受限。另外，自2004年地衣芽孢桿菌的全基因組測序完成以后，基因工程技術逐漸被應用在桿菌肽生產(chǎn)的研究中［10］。根據(jù)提高桿菌肽合成前體氨基酸的胞內(nèi)含量來促進桿菌肽合成的思路，過表達葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因zwf，通過提高NADPH/NADH比例來保證桿菌肽前體氨基酸的胞內(nèi)供給，繼而實現(xiàn)桿菌肽效價的提高［11］。同樣，通過失活或過表達支鏈氨基酸胞內(nèi)外轉運蛋白基因yhdD和brnQ，也實現(xiàn)了對桿菌肽合成的改善［12-13］。但遺憾的是，基因工程菌可能涉及到生物安全問題，并且簡單的分子操作對工業(yè)生產(chǎn)菌株的育種效果往往并不明顯［14］。從微生物育種技術的發(fā)展史來看，傳統(tǒng)誘變選育由于篩選通量低和人工負擔重的限制，影響了其在選育優(yōu)良菌株方面的應用。隨著高通量篩選（High-throughput screening，HTS）技術的興起與發(fā)展，其作為傳統(tǒng)誘變選育技術的升級，實現(xiàn)了誘變選育工作的自動化、規(guī)模化和小型化。總之，HTS技術解決了傳統(tǒng)誘變選育“篩”的問題，并在大規(guī)模篩選和不需要了解產(chǎn)物合成遺傳背景的優(yōu)勢下，用來提高桿菌肽這種次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，勢必將具有更加廣闊的前景。

在本研究中，采用常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）對細胞進行誘變，并借助流式細胞儀（Flow cytometer，F(xiàn)CM）分選出誘變后的活細胞至96孔板中培養(yǎng)。根據(jù)桿菌肽分子中酰胺鍵能與銅離子在堿性環(huán)境下反應的化學性質，建立了雙縮脲反應結合三氯醋酸（Trichloroacetic acid，TCA）沉淀的高通量初篩方法。利用酶標儀檢測反應顏色，快速鎖定陽性突變，極大的提高了篩選的通量和縮短了育種的周期?？傊狙芯刻峁┝艘环N提高桿菌肽產(chǎn)量的新方法，并可以應用于其他多肽產(chǎn)品的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformisDW2，DW2菌株），由齊魯制藥（內(nèi)蒙古）有限公司提供。

1.1.2 主要儀器 FACSAriaTMⅢ流式細胞儀，美國BD公司；ARTP 儀，無錫源清天木生物科技有限公司；Cytation3 酶標儀，美國 BioTek 公司；安捷倫 1260高效液相色譜，美國 Agilent 公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基（g/L）:酵母浸膏20、氯化鈉5、硫酸鎂0.5；固體培養(yǎng)基（斜面）:在液體培養(yǎng)基中加2%的瓊脂粉；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）:豆粕粉60、玉米淀粉40、花生餅粉5、玉米干漿2、玉米漿2、碳酸鈣4、硫酸銨1和高溫淀粉酶0.1。上述培養(yǎng)基全部用2 mol/L氫氧化鈉調pH值至7.5，并在121℃條件下滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 ARTP誘變 挑取地衣芽孢桿菌平板單孢子至液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600=1.2-1.4。取1 mL菌液離心收集細胞，用5%的甘油作為保濕劑的生理鹽水洗滌3次，并取1 mL上述溶液重懸。取10 μL細胞溶液均勻涂抹至無菌載片表面，在放電功率100 W和氮氣流量10 SL/min的條件下，分別處理 0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、80 s、100 s和120 s。然后，將載片轉移至裝有PBS緩沖液1 mL的EP管中，充分振蕩洗脫。將洗脫的菌液適當稀釋，并取100 μL涂布至固體平板培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h計數(shù)。

1.2.2 高通量初篩流程 利用FCM將單細胞分選至裝有200 μL液體培養(yǎng)基的96孔板中，37℃、750 r/min培養(yǎng)20 h。取100 μL培養(yǎng)好的種子液轉接至裝有1 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的48深孔板中，37℃、220 r/min發(fā)酵培養(yǎng)54 h。發(fā)酵結束后，加入15%的TCA溶液1 mL，在220 r/min條件下振蕩2 min充分混勻，在室溫靜置30 min使沉淀充分。然后，將深孔板在4℃、4 500 r/min條件下離心15 min，取發(fā)酵上清液80 μL至新的96孔板中，并與120 μL雙縮脲試劑反應5-10 min。最后，利用酶標儀在548 nm波長下檢測吸光值，根據(jù)吸光值大小判斷出高產(chǎn)的突變菌株。

1.2.3 搖瓶復篩 將初篩得到的突變菌株，取其96孔板保藏的種子液均勻涂布在固體斜面表面，37℃恒溫培養(yǎng)27 h。菌體斜面用3.5 mL無菌水充分洗脫并使細胞均勻分散，取1 mL菌液接種至裝有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37℃、220 r/min發(fā)酵培養(yǎng)48 h，高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）檢測發(fā)酵液中桿菌肽效價。

1.2.4 死細胞染色條件優(yōu)化 挑取平板活化的單孢子至液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600=1.2-1.4。利用PBS洗滌和重懸細胞，并將細胞溶液沸水浴20 min。取100 μL沸水處理的細胞溶液 分 別 和 0 μL、10 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL和100 μL體積的 50 μg/mL的PI儲存溶液（PBS配制）混合均勻，然后再用PBS定容至200 μL后放置冰里避光，分別反應0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min。染色結束后，立即取出染色的細胞溶液并用PBS定容至1 mL使染色停止。利用FCM分析染色結果，陽性信號比例越高則染色效果越好，信號比例由軟件自動計算顯示。

1.2.5 FCM分選方案 為更好的進行單細胞分選，分選前合適的圈門邏輯是實現(xiàn)好的分選效果的保證。首先，創(chuàng)建收集熒光信號的散點圖FCS-A/PerCPCy5-5-A，坐標為信號對數(shù)值。利用不經(jīng)過染色的空白對照設置電壓，使細胞的本底熒光信號集中在101以內(nèi)。其次，保持電壓不變，將陽性對照樣品上樣分析。創(chuàng)建PerCP-Cy5-5-A直方圖和FSC-A/SSC-A散點圖，在FSC-A/SSC-A散點圖中設門圈中信號，并調整門的位置和大小。當觀察到PerCP-Cy5-5-A直方圖為類似標準的正態(tài)分布形狀時，此時圈中信號的門最佳。在分選之前應先創(chuàng)建FSC-A/FSC-H 和SSC-A/SSC-H散點圖，去除目標細胞群中的粘連細胞信號。

1.2.6 雙縮脲試劑制備 根據(jù)文獻［15］配制雙縮脲試劑。

1.2.7 分析方法 發(fā)酵液中的桿菌肽效價用HPLC檢測，檢測方法與文獻［1］報道的一致。發(fā)酵樣品先與40 g/L的EDTA溶液等體積混合，在4℃條件下反應2 h，桿菌肽的總效價通過計算桿菌肽A和桿菌肽B的總峰面積得到。

2 結果

2.1 ARTP致死曲線繪制

由放電產(chǎn)生的等離子體，可在室溫下導致細胞膜通透性增加，進而損傷DNA。細胞致死曲線表明（圖1），ARTP處理15 s時，細胞的致死率為26%。處理時間為15 s-100 s時，細胞致死率增加緩慢，而當處理時間超過100 s，不超過120 s時，細胞的致死率增加明顯。這種增長可能與亞致死效應的增強有關，而此時有利于造成DNA的損傷。因此，選取100 s、110 s和120 s三個時間點來構建突變細胞文庫，與之對應的細胞致死率在70%-80%左右。

圖1 ARTP誘變致死曲線

2.2 HTS方法的建立

本研究取120 μL桿菌肽標準溶液與80 μL雙縮脲試劑混勻顯色，光譜掃描顯示雙縮脲反應顏色在548 nm處出現(xiàn)光吸收峰值（圖2-A）。配制桿菌肽標準品梯度溶液，與雙縮脲試劑充分反應后在548 nm處檢測吸光值（圖2-B）。結果表明，在桿菌肽濃度和吸光值之間有很好的相關性（R2=0.995 89）。為排除發(fā)酵液中雜蛋白對顯色的干擾，本研究選擇TCA作為沉淀劑。取1mL 15%的TCA溶液與深孔板發(fā)酵液振蕩混勻并充分沉淀。取80 μL沉淀處理后的發(fā)酵上清液，與120 μL雙縮脲試劑充分混勻反應，在548 nm處檢測吸光值。隨機取深孔板發(fā)酵液并用HPLC檢測桿菌肽效價，驗證深孔板中桿菌肽效價與吸光值之間相關性（圖3）。結果表明，HPLC檢測的桿菌肽效價與多孔板檢測的吸光值之間有較好相關性（R2=0.945 28）。因此，可選擇用15%的TCA溶液1mL沉淀深孔板發(fā)酵液，再用沉淀處理后的發(fā)酵上清液80 μL與120 μL雙縮脲試劑反應作為高通量初篩方法。

圖2 雙縮脲反應的光譜掃面和標準曲線

圖3 多孔板檢測和HPLC檢測的相關性

2.3 PI染色和FCM分選

優(yōu)化PI染色死細胞條件的結果如表1所示。隨著PI溶液體積的增加和避光染色時間的延長，陽性信號的比例逐漸增加。而當PI儲液體積大于40 μL且染色的時間超過20 min時，陽性信號的比例不再增加或明顯增加。另外，為避免PI染色誘變后的活細胞，將PI染色死細胞的條件確定為100 μL細胞溶液與40 μL的PI溶液在200 μL的體系中置冰上避光染色20 min。最后通過優(yōu)化的染色條件和設置合理的圈門方案，將細胞分選至96孔板中，可在固體培養(yǎng)基上觀察到生長出單菌落（圖4）。經(jīng)過實踐檢驗，此分選方案可使細胞的回收率平均達95%以上。

表1 PI染色死細胞條件優(yōu)化

圖4 在96孔板中生長的細胞

2.4 HTS桿菌肽高產(chǎn)菌株

在本研究中，將20塊96孔板的1 920株突變菌株，通過高通量初篩選出14株菌用于搖瓶復篩，搖瓶中檢測到最高桿菌肽效價的菌株直接用于下一輪誘變篩選。此外，用HPLC檢測篩選出的14株菌其深孔板發(fā)酵液效價，并以誘變次數(shù)為橫坐標作圖（圖5）。當誘變至第11代時，篩選到了深孔板發(fā)酵桿菌肽效價最高的突變菌株。當誘變至第6代時，篩選到第一株能夠穩(wěn)定遺傳的桿菌肽高產(chǎn)菌株1#7E（圖6-A和6-B），相對出發(fā)菌株提高10.8%。然后繼續(xù)在高產(chǎn)菌株1#7E的基礎上誘變至第8代獲得8#6D和7#5E，相對出發(fā)菌株都提高20.9%。最后在誘變至11代時，獲得高產(chǎn)菌株6#7E、5#8D和2#5F，分別相對出發(fā)菌株提高20.8%、19.7% 和22.2%，并通過遺傳穩(wěn)定性驗證，最終確定為高產(chǎn)桿菌肽菌株，桿菌肽最高效價為912 U/mL（圖6-C和6-D）。繼續(xù)誘變至第15代，但未能篩選到桿菌肽產(chǎn)量進一步提高的突變菌株。

圖5 高通量初篩

圖6 搖瓶復篩

3 討論

通常情況下，優(yōu)良菌株的獲得主要依靠兩種策略:一是通過隨機誘變結合定向篩選獲取有用突變菌株；二是基于對目標產(chǎn)物代謝過程的理解，通過代謝工程和基因工程改造獲得有用工程菌株。前者隨著篩選策略和方法的發(fā)展而得到加強，后者則隨著組學技術和基因工程工具的發(fā)展而得到加強。微生物學的發(fā)展使第二種方法的應用取得了巨大的成功，但對于多數(shù)工業(yè)菌株的改良而言，由于它們本身已優(yōu)于利用第二種方法改造的菌株，所以仍然以第一種方法作為主要手段。

HTS技術對于利用第一種方法進行微生物育種變得越來越重要，特別是高通量培養(yǎng)（High-throughput cultivation）技術，解決了細胞在微型容器生長和發(fā)酵過程中關于溶氧和染菌等問題。本研究利用96孔板生長培養(yǎng)和48深孔板發(fā)酵培養(yǎng)，可以保障細胞的正常生長與發(fā)酵，為HTS技術的應用提供了可能。與此同時，HTS技術不僅僅以生產(chǎn)力作為篩選的唯一結果導向，培養(yǎng)的規(guī)?；癁樵诤Y選過程中考察細胞形態(tài)、生長周期和發(fā)酵過程的顏色甚至氣味變化提供了途徑，有利于擴展我們對微生物細胞的認知。除此之外，規(guī)?；奶攸c使利用HTS技術選育環(huán)境中有用微生物同樣具有優(yōu)勢。FCM自20世紀問世以來就作為研究細胞的工具而得到廣泛的應用，現(xiàn)如今FCM已發(fā)展成HTS育種的一部分［16］。本研究在FCM的幫助下，以每150 s分選96個單細胞至96孔板的速度分選，極大的節(jié)省了時間，并滿足了HTS的需要。與通常情況下利用FCM分選攜帶熒光信號的細胞不同，本研究分選未攜帶熒光信號的細胞，需克服背景信號的干擾問題。通過設置空白和陽性對照進行合理的圈門，有利于劃清與無效信號的界限，繼而提高細胞的回收率。目前，功能最為完善的FCM可以同時分析超過50種熒光，從而能對樣品中稀有細胞進行快速富集。實際上，由于選擇合適的熒光標簽能夠區(qū)分不同類或生理狀態(tài)的細胞，所以特異性染色或表達內(nèi)源熒光通常對于目標細胞的篩選有事半功倍的作用。本研究結合FCM分選來滿足基于多孔板HTS的需要，卻對FCM分析功能的利用非常有限，這為我們下一步工作提供了改進的空間。

對于桿菌肽合成調控的認知通常停留在由Spo0A，AbrB和σH組成的三組分管理系統(tǒng)［17］。但由于全局調控因子AbrB的改造影響細胞生長的其他過程，所以對于桿菌肽合成調控的研究依然是個難題［18］。地衣芽孢桿菌DW2的全基因組測序已經(jīng)完成，比較基因組學（Comparative genomics）將在地衣芽孢桿菌的基因組學研究中起著重要的作用［18］。將全基因組重測序與HTS育種相結合，發(fā)現(xiàn)有利于桿菌肽合成的變異位點并解析相關突變基因的功能，從理論上指導進一步提高桿菌肽的積累是可行的。與此同時，通過菌株工程能夠在復制、轉錄和翻譯水平上，實現(xiàn)對指定途徑進行遺傳多樣性的隨機操作，爭取從建構突變文庫方面尋找新的突破口［19］。因此，基于上述調查，HTS技術將在桿菌肽產(chǎn)量的研究中繼續(xù)發(fā)揮作用。

4 結論

本研究建立了一種FCM協(xié)助下的HTS方法，基于ARTP誘變獲得突變菌株文庫，并成功從文庫中篩選出桿菌肽高產(chǎn)菌株。這個方法的主要特征在于建立的雙縮脲顯色結合TCA沉淀的高通量初篩方法，并篩選到桿菌肽產(chǎn)量提高超過20%的地衣芽孢桿菌DW2突變菌株。利用FCM將單細胞分選至96孔板中，保證了細胞分選后的活性，使細胞回收率達到95%以上，極大的擴大了篩選規(guī)模，從而縮短了育種的周期。