張文 劉照貞 李俊碩 商營利

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 山東省動物生物工程與疫病防治重點實驗室，泰安 271018）

豬圓環(huán)病毒II型（Porcine circovirus 2，PCV2）感染引起的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。≒CV2-associated diseases，PCVD）是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一。當(dāng)前，我國豬群中PCV2的感染率高、流行范圍廣，死亡率可達(dá)10%以上，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。雖然已有多種疫苗免疫防控，但由于對PCV2的致病機(jī)制尚不完全清楚以及病毒的持續(xù)變異，臨床上仍難以控制該病毒的感染。目前已發(fā)現(xiàn) PCV2有 5個基因型（PCV2a-e）［2］，其中 PCV2a，PCV2b和 PCV2d流 行 率 較 高［3］， 而PCV2b是近年來國內(nèi)流行毒株的主要優(yōu)勢基因型［4］。PCV2b基因組全長約1.7 kb，包含11個開放閱讀框（ORF1-11）［5］，其中ORF2編碼的結(jié)構(gòu)性蛋白Cap包含了病毒的主要抗原決定簇，與宿主的免疫相關(guān)，具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，且與PCV1 Cap蛋白無抗原交叉反應(yīng)［6］。因此，Cap蛋白是流行病學(xué)診斷和疫苗研究的關(guān)鍵蛋白，同時也是制備抗PCV2抗體的理想抗原［7］。

已有多項研究通過原核或真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了全長或截短形式的PCV2 Cap蛋白，并制備了抗Cap的單克隆或多克隆抗體，但受到Cap表達(dá)量低，或不能實現(xiàn)可溶性表達(dá)以及制備成本高等諸多因素影響，制備的抗體存在效價較低或應(yīng)用范圍窄等局限［8-12］。因此，制備高效價、應(yīng)用廣的抗PCV2b Cap抗體對于PCV2b的臨床診斷和科學(xué)研究均具有重要意義。本研究通過優(yōu)化表達(dá)條件，利用大腸桿菌表達(dá)了不含核定位信號肽的PCV2b Cap截短蛋白，實現(xiàn)了大量可溶性表達(dá)，并將純化的重組Cap蛋白免疫實驗兔，制備了高效價抗PCV2b Cap的多克隆抗體。該抗體能應(yīng)用于免疫印跡、間接免疫熒光和免疫組化等多種檢測方法中，且特異性好，為PCV2b的臨床診斷及致病機(jī)制研究提供了有利工具。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-30a質(zhì)粒、BL21（DE3）菌株、JM109菌株由本實驗室保存；PCV2b毒株IDSDTA2017-1（Genbank number:MN400446）由本實驗室分離保存；小鼠抗His標(biāo)簽抗體購于北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；山羊抗兔HRP-IgG購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Alexa Fluor 594 山羊抗兔IgG購于Proteintech Group，Inc；DAPI、山羊血清購于北京索萊寶科技有限公司；DMEM和青鏈霉素混合液購自Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清購自 Biological Industries（BI）；PrimeSTAR HS DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、Premixed Protein Marker等均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；HisTrap HP層析柱購于GE公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購于Sigma-Aldrich公司；新西蘭大白兔購自山東濟(jì)南金豐實驗動物有限公司；C57BL/6小鼠購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離鑒定 取臨床診斷疑似圓環(huán)病毒感染的病豬肝臟、肺臟和淋巴結(jié)組織，以PCR檢測PCV2感染情況。將鑒定為PCV2單陽性的組織樣品研磨液，4℃，13 500×g，離心10 min后，以0.22 μm濾器過濾除菌后加入單層生長的PK-15細(xì)胞中培養(yǎng)，盲傳3代，PCR鑒定分離的PCV2病毒，進(jìn)一步對ORF2基因進(jìn)行測序鑒定。

1.2.2 蛋白原核表達(dá)及純化 參考文獻(xiàn)報道［13］的PCV2 ORF2序列的核定位信號肽，設(shè)計引物（表1），以PCV2b毒株DNA為模板擴(kuò)增不含NLS的ORF2基因片段，序列長度為585 bp，克隆至原核表達(dá)載體pET-30a上，測序正確后將重組質(zhì)粒pET30a-ORF2（His標(biāo)簽）轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中。通過優(yōu)化最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件:37℃，220 r/min，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，收集菌體，超聲裂解菌體，4℃，13 500×g離心30 min，收集上清液，利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)和HisTrap柱（GE Healthcare）純化Cap蛋白。

表1 PCV2 ORF2序列擴(kuò)增及PCV2病毒鑒定引物

1.2.3 兔源多克隆抗血清制備 根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法［14］對家兔進(jìn)行抗原免疫。取純化的Cap蛋白1 mg與等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，將乳化后的抗原在實驗兔背部皮下多點注射進(jìn)行免疫，分別于首免后第4周和第6周取純化的Cap蛋白0.5 mg與等體積的弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，皮下多點注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，三免后14 d采血分離血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 間接ELISA 取純化的Cap蛋白，以PBS（pH 7.2）稀釋為終濃度10 μg/mL 4℃過夜包被96孔板。以1% BSA 37℃封閉1 h后分別加入不同倍比稀釋濃度的抗血清，室溫孵育1 h，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，TMB顯色液室溫顯色15 min，2 N H2SO4終止顯色，酶標(biāo)儀讀取OD450nm值。免疫后與免疫前血清吸光度比值（P/N值）大于2.1即判定為陽性［15］。

1.2.5 免疫球蛋白IgG純化 抗血清中免疫球蛋白IgG純化采用辛酸-硫酸銨沉淀法［16］。首先將抗血清以醋酸鹽緩沖液（pH 4.5）按1∶4稀釋后，向混合液中緩慢滴加正辛酸（250 μL/10 mL混合液），室溫攪拌30 min沉淀雜蛋白，然后2 700×g，4℃離心30 min收集上清，定性濾紙過濾去除雜蛋白。將過濾液用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）按10∶1的比例混合，于4℃緩慢加入固體硫酸銨（2.77 g/10 mL），攪拌30 min鹽析沉淀IgG，2 700×g離心15 min收集沉淀，將沉淀的IgG以PBS重懸，透析獲得高純度抗Cap多克隆抗體，-80℃保存。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒感染模型 PK-15豬腎細(xì)胞系以含青鏈霉素的10% FBS（Biological industries）的DMEM（Gibco）中置于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。PK-15細(xì)胞鋪于12孔板中，將IDSDTA2017-1毒株或其他PCV2臨床分離株感染PK-15細(xì)胞，感染48 h后收集并裂解細(xì)胞提取總蛋白，進(jìn)行免疫印跡檢測。

1.2.7 PCV2感染小鼠模型 參考文獻(xiàn)報道［17-19］并稍修改，具體方法為取7周齡C57BL/6小鼠，每只小鼠腹腔注射3.5×104PFU的PCV2b病毒，對照組腹腔注射DMEM培養(yǎng)基，感染3 d后取小鼠肝臟、脾臟和腎臟組織進(jìn)行免疫組化檢測。

1.2.8 免疫印跡 收集PCV2b感染的PK-15細(xì)胞，以SDS細(xì)胞裂解液（2% SDS，50 mmol/L Tris-HCl，10%甘油，100 mmol/L DTT，0.1%溴酚藍(lán)，pH6.8）裂解細(xì)胞提取總蛋白。將樣品進(jìn)行12%的SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫封閉后，分別以制備的抗血清和純化后多克隆抗體4℃孵育過夜，HRP酶標(biāo)二抗室溫孵育后，顯色拍照。

1.2.9 間接免疫熒光 細(xì)胞爬片以4%多聚甲醛室溫固定20 min后，以0.1% Triton X-100冰上處理細(xì)胞5 min，5%正常山羊血清室溫封閉30 min。將純化后的IgG稀釋不同比例與待檢細(xì)胞室溫孵育1.5 h，加入Alexa Fluor 594標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗（1∶200），室溫避光孵育、洗滌、最后以含DAPI的封片劑進(jìn)行封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.10 免疫組織化學(xué) 取小鼠肝臟、脾臟和腎臟組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋和切片（3 μm）。石蠟切片脫蠟至水，5%正常山羊血清封閉后加不同稀釋濃度的抗Cap多克隆抗體4℃過夜孵育。PBS洗滌后以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶100）室溫孵育1 h后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 PCV2b Cap融合蛋白的可溶性表達(dá)和純化

為了獲得大量的可溶性重組PCV2b Cap蛋白用于制備多克隆抗體，根據(jù)文獻(xiàn)報道［20］分析了Cap的氨基酸序列，確定前41個氨基酸為核定位信號肽（Nuclear location sequence，NLS）。為了在大腸桿菌中高效表達(dá)Cap蛋白抗原，將不含NLS基因序列的長度為585 bp的PCV2b（IDSDTA2017-1株）的ORF2克隆至pET30a表達(dá)載體中（圖1-A），并對重組載體進(jìn)行了測序驗證。將測序正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）表達(dá)菌中，以1∶100的稀釋比例轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600nm為0.5，加入0.5 mmol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h后收集菌體。取超聲裂解后的菌體上清進(jìn)行SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色檢測重組Cap蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在約29 kD處有明顯條帶，與預(yù)期大小相符，表明目的蛋白表達(dá)成功，且為可溶性表達(dá)（圖1-B，Lane4-5）。利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)以1 mL HisTrap HP柱（GE Healthcare）純化上清液中的Cap蛋白，發(fā)現(xiàn)在20 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液，500 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液條件下，純化蛋白可獲得單一條帶（圖1-C）。為進(jìn)一步驗證純化的蛋白為Cap蛋白，純化的融合蛋白用His標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，可在約29 kD處檢測到單一條帶（圖1-D）。以上結(jié)果表明，PCV2b Cap融合蛋白被成功表達(dá)和純化。

圖1 PCV2b-Cap融合蛋白的表達(dá)及純化

2.2 抗PCV2b Cap蛋白多克隆抗體的制備及抗血清效價測定

為了制備抗PCV2b Cap蛋白多克隆抗體，將純化后的Cap蛋白免疫新西蘭白兔，三免后采集血清，以ELISA測定抗血清的效價，結(jié)果顯示本次制備的抗血清效價最高可達(dá)1∶107（圖2、表2）。以上結(jié)果表明純化的截短型Cap蛋白具有良好的免疫原性，并成功獲得了高效價的抗PCV2b Cap抗血清。

圖2 ELISA檢測抗PCV2b Cap蛋白多克隆抗體效價

表2 抗PCV2b Cap蛋白多克隆抗體效價P/N值

2.3 抗血清的純化及多克隆抗體特異性檢測

為了檢測所制備的抗血清的特異性，將抗血清進(jìn)行稀釋作為一抗對感染PCV2b的細(xì)胞樣品進(jìn)行了免疫印跡檢測。結(jié)果顯示，與未感染PCV2b的對照樣品相比，抗血清可在感染PCV2b細(xì)胞裂解樣品中約29 kD處檢測到明顯的差異表達(dá)條帶（圖3-A），但同時有非特異性條帶。為了提高抗體的特異性，將制備的抗血清利用辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化，將純化后的IgG進(jìn)行SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色檢測，可看到明顯的重鏈和輕鏈兩條帶（圖3-B）。利用純化的IgG多克隆抗體對感染PCV2b的細(xì)胞裂解樣品進(jìn)行免疫印跡檢測，發(fā)現(xiàn)純化后的IgG特異性增強(qiáng)（圖3-C）。為進(jìn)一步驗證該抗體效價，分別對抗體進(jìn)行了不同比例稀釋，利用同一PCV2b感染的細(xì)胞樣品檢測，發(fā)現(xiàn)在相同曝光強(qiáng)度下，純化后的多克隆抗體在1∶20 000稀釋的情況下仍可見特異的目的條帶（圖3-D），表明該多克隆抗體具有較高的抗體效價。

圖3 抗PCV2b Cap多克隆抗體的純化及特異性檢測

2.4 應(yīng)用抗Cap多克隆抗體進(jìn)行免疫熒光和免疫組化檢測

為了證明純化的多克隆抗體是否可用于免疫熒光和免疫組化檢測，分別以1∶500和1∶50稀釋抗體對PCV2b病毒感染的PK15細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實驗和人工感染PCV2b的小鼠肝、脾、腎等組織進(jìn)行免疫組化檢測。結(jié)果顯示，制備的抗Cap蛋白多克隆抗體可以檢測到特異性的紅色熒光（圖4-A）和特異性組化顯色褐色（圖4-B）。與之對應(yīng)，對照細(xì)胞和對照組織中則均為陰性。以上結(jié)果表明純化后的抗Cap多克隆抗體可以特異性識別PCV2b病毒，并能夠應(yīng)用于免疫熒光和免疫組化染色。

圖4 免疫熒光和免疫組化分析純化的抗Cap多克隆抗體的特異性

2.5 抗Cap多克隆抗體對臨床分離毒株的檢測

為了進(jìn)一步驗證該多克隆抗體對于其他PCV2b分離毒株的檢測效果，從PCR檢測PCV2單陽性的臨床病豬肝臟、肺臟和淋巴結(jié)中分離了3株P(guān)CV2b毒株（PCV2b 1-3）（圖5-A）。對ORF2序列鑒定為PCV2b毒株，氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)分離的3株P(guān)CV2b毒株與制備抗體的毒株為不同的毒株（圖5-B）。利用免疫印跡檢測這些分離株感染的PK-15細(xì)胞，結(jié)果顯示制備抗體均能檢測到3株不同PCV2b的Cap蛋白表達(dá)（圖5-C），表明該多克隆抗體可用于臨床PCV2b感染的檢測。

圖5 抗Cap多克隆抗體檢測臨床分離PCV2b的病毒感染

3 討論

PCV2感染會引發(fā)豬的免疫抑制，使機(jī)體抵抗力下降，繼發(fā)其他病原感染導(dǎo)致豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對于PCV2的致病機(jī)制不清楚，PCV2特異性的抗體是研究病毒感染與致病機(jī)制的重要工具之一。目前已有的商品化抗PCV2 Cap蛋白的抗體主要以PCV2a型為主，但自2003年以來豬場PCV2毒株基因型已發(fā)生由a型向b型的轉(zhuǎn)變，PCV2b型成為國內(nèi)主要流行毒株［21］，毒力最強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)新的PCV2b變異株不斷出現(xiàn)，這些變異株表現(xiàn)為PCV2衣殼蛋白氨基酸序列的突變［20］，導(dǎo)致商品化的抗體難以適用于臨床分離的PCV2b變異株的檢測。PCV2編碼的Cap蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，含多種抗原表位，也是病毒的主要免疫原［22］，是制備檢測PCV2抗體的理想抗原。

目前，國內(nèi)外已有許多學(xué)者利用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了PCV2b Cap蛋白，制備抗PCV2b Cap的抗體。通過大腸桿菌表達(dá)全長PCV2 Cap蛋白主要是包涵體形式，且產(chǎn)量極低，而包涵體中Cap蛋白不利于抗原表位的展示［23］。利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Cap蛋白，雖實現(xiàn)了蛋白的可溶性表達(dá)，但表達(dá)量低，成本較高［10］。PCV2病毒的ORF2基因編碼的N端41位氨基酸為核定位信號肽（Nuclear localization signal，NLS），序列中30%為大腸桿菌稀有密碼子［24-25］。因此，表達(dá)ORF2全長時常導(dǎo)致蛋白表達(dá)量低。值得注意的是，PCV2 Cap蛋白的重要抗原決定簇并不在NLS中［13］。因此，本研究構(gòu)建了不含NLS的原核表達(dá)載體pET-30a-ORF2，利用大腸桿菌表達(dá)PCV2 Cap蛋白，同時優(yōu)化表達(dá)條件，實現(xiàn)了Cap的可溶性表達(dá)，便于后續(xù)純化及抗原表位的充分展示。

已有學(xué)者利用純化Cap蛋白制備單克隆抗體［12，26］，雖特異性強(qiáng)，但抗原表位單一，而PCV2病毒的變異速度快，平均每年每個位點為1.2×10-3替換［27］，因此多克隆抗體更適用于PCV2b的臨床檢測。本研究利用純化的Cap蛋白制備了兔源多克隆抗體，檢測其效價可達(dá)1∶107，與已報道多抗效價 1∶105相比［11，28］，抗體效價有了顯著性提高。與之對應(yīng)，本研究的抗體經(jīng)1∶20 000稀釋進(jìn)行免疫印跡，仍可獲得特異條帶。其原因可能是可溶形式的Cap蛋白，更接近天然蛋白的結(jié)構(gòu)，免疫原性強(qiáng)。此前的研究表明PCV2可以通過多種接種方式感染小鼠，包括腹腔注射、滴鼻、口服和肩胛骨區(qū)域肌肉注射等［17-18，29-30］。為了驗證制備的抗體是否能夠應(yīng)用于檢測體內(nèi)感染的PCV2，我們通過腹腔注射建立了病毒感染小鼠模型。已有研究表明每只小鼠腹腔注射 PCV2b 劑量可在 104-105PFU［17-18，29］，攻毒3 d后組織中病毒拷貝數(shù)明顯增加，而5 d后則明顯降低［18］。本研究以3.5×104PFU接種3 d后進(jìn)行免疫組化分析，可在PCV2感染的多個組織中檢測到特異性染色。證明該抗體可以用于檢測體內(nèi)感染的PCV2b。另外，應(yīng)用抗體進(jìn)行免疫熒光檢測也顯示較好的特異性。

4 結(jié)論

本研究以純化的不含NLS的PCV2b Cap蛋白作為免疫原，成功制備了特異、高效價的、具有廣泛應(yīng)用的多克隆抗體，為PCV2b的臨床檢測及深入研究圓環(huán)病毒的致病機(jī)制以及與宿主的相互作用機(jī)制提供了有效的候選工具。