陶 磊，陳金虎，張漢超，劉 彬，陳 瑩，萬 蘋，何 苗*，楊志斌*

（1.大理大學(xué)，云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000； 2.藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，四川成都 610000； 3.大理白族自治州人民醫(yī)院病理科，云南大理 671000； 4.云南省第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，云南大理 671000）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC） 屬于炎癥性腸病范疇，是一種以腸黏膜炎癥、潰瘍糜爛為病理特征的急、慢性結(jié)直腸病癥，其UC 臨床病癥難以治療，易復(fù)發(fā)，具有癌變傾向，被列為難治愈疾病之一［1］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為UC是在遺傳、環(huán)境等多種因素共同影響下，神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)和免疫失衡，導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷引起局部黏膜潰瘍［2］。目前西醫(yī)臨床治療藥物主要為氨基酸水楊酸類、免疫抑制劑類、糖皮質(zhì)激素類、生物制劑類，但多數(shù)藥物不良反應(yīng)多，療效不穩(wěn)定且伴有多種并發(fā)癥，生物制劑類還因價格昂貴、來源途徑窄、易耐受，使其在臨床使用上受到一定限制［3］；而中醫(yī)常辨證施治，以單方或復(fù)方湯劑、中成藥治療UC，且較西醫(yī)有不良反應(yīng)少、可緩解臨床癥狀和降低復(fù)發(fā)率的優(yōu)勢［4］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，中藥主要通過多成分協(xié)同調(diào)節(jié)免疫和抗炎途徑達到緩解及治療UC［5］。

美洲大蠊Periplaneta americanaL.是蜚蠊科大蠊屬昆蟲，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。其主要含有信息素、生物堿及神經(jīng)肽類等化學(xué)成分，具有組織修復(fù)、抗癌、消炎消腫、抗菌等作用［6］?；谡n題組前期發(fā)現(xiàn)［7］美洲大蠊提取物能緩解UC 疾病活動情況，降低死亡率，故本次擬通過三硝基苯磺酸／乙醇法構(gòu)建大鼠UC 模型，研究美洲大蠊提取物對UC 大鼠的影響并初步探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級SD 大鼠，180～220 g，雌雄各半，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，使用許可證號SYXK （滇） -2011-0004。

1.2 試劑與藥物 美洲大蠊購自好醫(yī)生藥業(yè)集團，經(jīng)大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院動物學(xué)教授楊自忠鑒定為蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬美洲大蠊Periplaneta americanaL.。取美洲大蠊干品，70% 乙醇加熱回流提取3 次，過濾，合并濾液，濃縮至密度1.25 g／mL，加水脫脂，過濾，濾液濃縮至浸膏，即得美洲大蠊提取物（批號20150317，藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心張成桂副教授提供）。柳氮磺胺吡啶腸溶片（批號20160505） 購自上海信誼天平藥業(yè)有限公司；腸炎寧（批號Z36020518） 購自江西天施康弋陽制藥有限公司；MPO 試劑盒（批號20161209）、隱血試劑盒（批號20160824） 購自南京建成生物工程研究所；IL-17 試劑盒（批號R161025-170b）、IL-4 試劑盒（批號R160927-002b） 購自欣博盛生物科技有限公司；IFN-γ 試劑盒（批號E3000-1609-1）、EGF 試劑盒 （批號R161214-104a）、TGF-β1 試劑盒（批號R161101-107a）、TNF-α 試劑盒（批號E3720-1680-2） 購自達科為生物科技有限公司。

1.3 儀器 HC-3018R 型高速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；先行者CP214 型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)BI-2000 （成都泰盟科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模 74 只SPF 級SD 大鼠，正常飼養(yǎng)7 d，根據(jù)張漢超等［8］報道的方法對大鼠進行造模，10% 水合氯醛（3 mL／kg） 麻醉大鼠后將其倒立，直徑2 mm 聚乙烯管輕輕插入大鼠肛門深度約8 cm，將0.6 mL 5%三硝基苯磺酸的30%乙醇溶液由注射器經(jīng)導(dǎo)管緩慢灌注，拔出聚乙烯管并將大鼠進行10 s 倒立。正常對照組同等操作灌腸給予等體積氯化鈉注射液。

2.2 分組及給藥 三硝基苯磺酸／乙醇法致大鼠UC 模型建立后第7 天，參考Hamamoto 等標準［9］進行疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI） 評分，根據(jù)DAI 評分（0～3 分，極輕度炎癥；4～6 分，輕度炎癥；7～9 分，中度炎癥；10～12 分，重度炎癥） 進行分組，選擇可納入實驗的輕中度炎癥造模大鼠60 只。根據(jù)DAI 評分分層后隨機分為模型組，腸炎寧組（600 mg／kg），柳氮磺胺吡啶組（300 mg／kg），美洲大蠊提取物低 （50 mg／kg）、中（100 mg／kg）、高（200 mg／kg） 劑量組，于模型建立第8天進行相應(yīng)給藥治療，灌胃給藥，其中正常對照組和模型組給予氯化鈉注射液，1 次／d，連續(xù)14 d。給藥第1、4、7、14 天進行DAI 評分。

2.3 血清IL-4、TNF-α、IFN-γ、IL-17 水平測定 末次給藥后禁食不禁水24 h，水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血于4 ℃靜置凝固，以3 000 r／min 離心10 min 取血清，采用ELISA 法檢測IL-4、TNF-α、IFN-γ、IL-17 水平。

2.4 肝臟、脾臟、胸腺和結(jié)腸指數(shù) 取出肝、脾、胸腺、結(jié)腸后，生理鹽水涮洗干凈后用濾紙將多余液體吸附，稱定質(zhì)量，計算相應(yīng)臟器指數(shù)，臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量／體質(zhì)量。

2.5 結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)評分 肉眼觀察結(jié)腸組織黏膜損傷情況，參照Luk 等［10］標準進行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（Colonmucosa damage index，CMDI） 評分。

2.6 結(jié)腸EGF、TGF-β1、MPO 水平測定 取結(jié)腸病變部位組織0.15 g，生理鹽水按1∶9比例勻漿，離心后取上清液，ELISA 法檢測EGF、TGF-β1 水平，試劑盒檢測MPO水平。

2.7 結(jié)腸病理形態(tài)觀察 取約0.5 cm×0.5 cm 病變部位結(jié)腸，福爾馬林溶液固定，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理切片，參照Ekstr?m 等［11］標準并進行結(jié)腸結(jié)腸病理形態(tài)觀察評分（histopathological score，HS）。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0 進行分析。數(shù)據(jù)以（）表示，服從正態(tài)分布，多組間比較采用單因素方差分析；不服從正態(tài)分布，采用秩和檢驗，以P≤0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 美洲大蠊提取物對UC 大鼠DAI 評分的影響 建模后第1 天，與正常對照組比較，其余各組大鼠出現(xiàn)毛色無光澤、少動嗜睡、厭食、大便隱血或血便等現(xiàn)象。給藥第1天各造模組大鼠DAI 評分較正常對照組升高（P＜0.01）。給藥第14 天，模型組DAI 評分較正常對照組仍升高（P＜0.01），提示模型持續(xù)存在；經(jīng)柳氮磺胺吡啶、腸炎寧、美洲大蠊提取物干預(yù)后，大鼠糞便部分由水樣稀便轉(zhuǎn)為較松散稀便，糞便隱血減少，活動增強、體質(zhì)量增加；與模型組比較，美洲大蠊提取物組和柳氮磺胺吡啶組DAI評分降低（P＜0.01）；與腸炎寧組比較，美洲大蠊提取物低、中劑量組DAI 評分降低（P＜0.01）；與柳氮磺胺吡啶組比較，美洲大蠊提取物中劑量組DAI 評分降低（P＜0.05）。見表1。

表1 美洲大蠊提取物對UC 大鼠DAI 評分的影響（， n＝10）

表1 美洲大蠊提取物對UC 大鼠DAI 評分的影響（， n＝10）

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，▲P ＜0.05；與腸炎寧組比較，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01。

3.2 美洲大蠊提取物對UC 大鼠臟器指數(shù)的影響 如表2所示，與正常對照組比較，模型組結(jié)腸指數(shù)升高（P＜0.01），肝臟、脾臟、胸腺指數(shù)無影響。美洲大蠊提取物組大鼠結(jié)腸指數(shù)較模型組、柳氮磺胺吡啶組和腸炎寧組降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 美洲大蠊提取物對UC 大鼠臟器指數(shù)的影響（mg／g，， n＝10）

表2 美洲大蠊提取物對UC 大鼠臟器指數(shù)的影響（mg／g，， n＝10）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與腸炎寧組比較，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01。

3.3 美洲大蠊提取物對UC 大鼠CMDI 評分的影響 如表3、圖1 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠腸壁有明顯充血、水腫、潰瘍形成，結(jié)腸黏膜病變嚴重，結(jié)腸長度和長寬比減小，CMDI 評分升高（P＜0.01）；與模型組比較，美洲大蠊提取物低劑量組結(jié)腸長度升高（P＜0.01），美洲大蠊提取物各劑量組結(jié)腸長寬比升高、CMDI 評分降低（P＜0.05，P＜0.01）；與柳氮磺胺吡啶組比較，美洲大蠊提取物各劑量組結(jié)腸長寬比升高（P＜0.01），CMDI 評分下降（P＜0.01）。

表3 美洲大蠊提取物對UC 大鼠結(jié)腸CMDI 評分的影響（， n＝10）

表3 美洲大蠊提取物對UC 大鼠結(jié)腸CMDI 評分的影響（， n＝10）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與腸炎寧組比較，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01。

圖1 美洲大蠊提取物對UC 大鼠結(jié)腸黏膜的影響

3.4 美洲大蠊提取物對UC 大鼠血清IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ 水平的影響 如表4 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清IL-4 水平降低 （P＜0.01），TNF-α、IL-17、IFN-γ水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清IFN-γ、TNF-α 水平降低（P＜0.01）；腸炎寧組和美洲大蠊提取物低、中劑量組IL-4 水平升高（P＜0.01）；除美洲大蠊提取物PABA1 低劑量組外，其他給藥組IL-17水平降低（P＜0.01）。與柳氮磺胺吡啶組比較，美洲大蠊提取物各劑量組TNF-α、IL-17 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），低、中劑量組IL-4 水平升高（P＜0.05）；與腸炎寧組比較，美洲大蠊提取物各劑量組IL-17 水平降低（P＜0.01）。

表4 美洲大蠊提取物對UC 大鼠血清IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ 水平的影響（， n＝10）

表4 美洲大蠊提取物對UC 大鼠血清IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ 水平的影響（， n＝10）

注：與正常對照組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與腸炎寧組比較，▽▽P＜0.01。

3.5 美洲大蠊提取物對UC 大鼠結(jié)腸EGF、TGF-β1、MPO水平的影響 如表5 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸EGF、TGF-β1 水平降低，MPO 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，美洲大蠊提取物各劑量組EGF、TGF-β1 水平升高（P＜0.01），美洲大蠊提取物中劑量組MPO 降低（P＜0.01）；與硫柳氮磺胺吡啶組和腸炎寧組比較，美洲大蠊提取物各劑量組EGF 水平升高（P＜0.01）。

表5 美洲大蠊提取物對UC 大鼠結(jié)腸EGF、TGF-β1 及MPO 水平的影響（， n＝10）

表5 美洲大蠊提取物對UC 大鼠結(jié)腸EGF、TGF-β1 及MPO 水平的影響（， n＝10）

注：與正常對照組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與腸炎寧組比較，▽▽P＜0.01。

3.6 美洲大蠊提取物對UC 大鼠結(jié)腸病理組織學(xué)的影響如表6、圖2 所示，除正常對照組外，其他組大鼠結(jié)腸黏膜呈不同程度潰瘍并伴有炎性細胞浸潤。模型組結(jié)腸HS評分高于正常對照組（P＜0.01）。美洲大蠊提取物各劑量組結(jié)腸HS 評分較模型組和硫柳氮磺胺吡啶組降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表6 美洲大蠊提取物對UC 大鼠HS 評分的影響（， n＝10）

表6 美洲大蠊提取物對UC 大鼠HS 評分的影響（， n＝10）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與腸炎寧組比較，▽P＜0.05。

4 討論

由三硝基苯磺酸／乙醇法誘導(dǎo)UC 大鼠模型是一種公認的造模方法。乙醇介導(dǎo)腸黏膜屏障破損，三硝基苯磺酸與腸黏膜組織蛋白結(jié)合成完全抗原，使T 淋巴細胞致敏，引起腸壁免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)［12］，其中CD4＋T 淋巴細胞引起的腸道損傷具有特征性和復(fù)發(fā)性。CD4＋T 淋巴細胞分為Th1 和Th2 亞群，Th1 可誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)，觸發(fā)免疫反應(yīng)及炎癥發(fā)生，Th2 可降低機體免疫反應(yīng)。在外來抗原刺激下，Th1、Th2 細胞激活并分化，其平衡狀態(tài)破壞，導(dǎo)致免疫功能紊亂［13］。本實驗采用三硝基苯磺酸／乙醇法誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎，各造模組大鼠于給藥第1 天其DAI 較正常對照組均顯著增加，給藥結(jié)束時模型組DAI 評分較正常對照組仍顯著增加，提示模型持續(xù)存在，經(jīng)美洲大蠊提取物治療后與模型組、柳氮磺胺吡啶組和腸炎寧組相比其DAI 均降低。

圖2 HE 染色檢測各組大鼠結(jié)腸病理組織學(xué)（×100）

TNF-α 由Th1 細胞和中性粒細胞分泌釋放，具有增加腸道上皮細胞通透性，啟動病理性Th1 介導(dǎo)的細胞免疫，破壞腸粘膜屏障功能［14］，促進Th1 分泌產(chǎn)生INF-γ，進而激活吞噬細胞及中性粒細胞，加重炎性反應(yīng)。模型組TNF-α、IFN-γ 水平升高，經(jīng)美洲大蠊提取物治療后抑制TNF-α、IFN-γ 表達，減緩炎癥，且美洲大蠊提取物治療后TNF-α 與腸炎寧組表達相當，較柳氮磺胺吡啶組降低。IL-4 由Th2 型細胞分泌，通過抑制IFN-γ、TNF-α 產(chǎn)生，達到抑制炎癥反應(yīng)并維持腸道免疫平衡的作用。美洲大蠊提取物治療后血清IL-4 水平顯著升高，說明美洲大蠊提取物能通過增強抑制炎癥達到回調(diào)Th1／Th2 失衡的作用。

IL-17 主要是由CD4＋T 細胞分泌促炎效應(yīng)因子，可活化T 細胞和刺激巨噬細胞產(chǎn)生多種炎癥因子，在炎癥發(fā)生過程中起重要調(diào)控作用［15］。MPO 由中性粒細胞分泌，其含有量升高會導(dǎo)致炎性細胞增殖和活化，導(dǎo)致炎癥部位組織細胞損傷，其活性間接反映腸道炎癥程度［16］。EGF、TGF-β1可促使分化基因表達及誘導(dǎo)細胞生長遷移，維持上皮細胞正常新陳代謝［17-18］，實驗結(jié)果顯示模型組EGF 和TGF-β1 水平顯著下降，經(jīng)美洲大蠊提取物治療后UC 大鼠結(jié)腸長度增長，CMDI 評分減少，上皮細胞恢復(fù)、炎性細胞浸潤程度降低，與結(jié)腸組織中EGF、TGF-β1 升高趨勢一致，提示美洲大蠊提取物能刺激細胞生長修復(fù)從而促進腸黏膜屏障功能恢復(fù)。但是美洲大蠊提取物各劑量組療效有所差別，推測經(jīng)灌胃給藥后，美洲大蠊提取物可能通過多成分、多靶點、多途徑發(fā)揮治療作用使實驗呈非線性結(jié)果［19］，后期將深入研究美洲大蠊提取物的量效關(guān)系。