劉小康，王玥玥，赫一鳴，王康宇，貢濟宇

（長春中醫(yī)藥大學藥學院，吉林長春 130117）

中藥作為一個復雜體系包含多種成分，目前我國現(xiàn)有的質(zhì)量標準主要是通過性狀鑒別、顯微鑒別和理化鑒別來確定真?zhèn)?，并以藥物中幾種成分為指標來進行含有量測定，不能反映其整體特征［1］。2015 年版《中國藥典》 一部重點加強中藥質(zhì)量的整體控制，完善中藥復雜體系質(zhì)量標準研究的思路、方法和模式，特別是中藥材標準中首次收入特征圖譜，使其質(zhì)量可控性增強［2］。一測多評法是近年來解決中藥多指標分析時對照品短缺問題的可行出路之一，例如鄒獻亮等［3］同時測定熟地黃中4種苯乙醇苷，蔡楚蘭等［4］同時測定參芪二仙片中9種成分，王鵬飛等［5］對蟾酥進行質(zhì)量控制。

醋五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill.的干燥成熟果實，秋季成熟時采摘，曬干或蒸后曬干，除去果梗和雜質(zhì)，加食醋蒸后曬干，即得［6］。本實驗建立醋五味子特征圖譜，結(jié)合木脂素類成分定量分析，增加了其質(zhì)量整體可控性，也體現(xiàn)了現(xiàn)代分析技術(shù)在建立符合中醫(yī)藥特點質(zhì)量標準體系方面的新進展，可促進相關(guān)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制的研究。

不同產(chǎn)地、炮制工藝等都可能造成市場上醋五味子飲片的質(zhì)量參差不齊，但2015 年版《中國藥典》 中其含有量測定項下未規(guī)定指標限量，缺少確切的質(zhì)量控制方法。本研究收集不同批次市售醋五味子飲片48 批，建立了HPLC 特征圖譜，采用一測多評法測定4 種木脂素含有量，以期全面反映該類成分相關(guān)信息，為炮制品質(zhì)量評價提供參考。

1 材料

LC-2030 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Waters Alliance 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；AB135-S 型電子分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）。五味子醇乙對照品（批號wkq18020804，純度≥98%，四川維克奇科技生物有限公司）；五味子醇甲 （批號110857-201815，純度≥98%）、五味子甲素（批號110764-201714，純度≥98%）、五味子乙素（批號110765-201512，純度≥98%） 對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈 （色譜級，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；其他試劑均為分析純；水為屈臣氏蒸餾水。

本研究收集了不同市售醋五味子飲片共48 批，具體見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hypersil C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動相乙腈（A） -水（B），梯度洗脫 （0～5 min，0～55% A；5～35 min，55%～85% A；35～40 min，85%～55% A；40～45 min，55% A～0）；檢測波長254 nm；體積流量1.0 mL／min；進樣量10 μL。理論塔板數(shù)按五味子醇甲計，應不低于2 000。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成分別含五味子醇甲0.328 mg／mL、五味子醇乙0.156 mg／mL、五味子甲素0.231 mg／mL、五味子乙素0.188 mg／mL，即得。

2.3 供試品溶液制備 稱取樣品（S1～S48） 粉末（過3 號篩） 各0.25 g，精密稱定，置于20 mL 量瓶中，加入20 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（250 W，20 kHz） 處理20 min，甲醇補充減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 醋五味子HPLC 特征圖譜［7-10］

2.4.1 特征圖譜建立 取樣品（S1～S48） 粉末，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，在“2.1”項條件下測定，記錄45 min 色譜圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012.1 版） 進行評價，設(shè)置S1 樣品圖譜為參照圖譜生成特征圖譜，共16 個特征峰，其中峰1 為五味子醇甲，峰4 為五味子醇乙，峰11為五味子甲素，峰14 為五味子乙素。見圖2。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取供試品溶液（S32），在“2.1”項條件下連續(xù)測定6 次，測得各特征峰與內(nèi)標峰（五味子醇甲） 比值的相對保留時間、相對峰面積RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

圖2 醋五味子HPLC 特征圖譜（254 nm）Fig.2 HPLC characteristic chromatogram of S.chinensis processing with vinegar （254 nm）

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液（S32），室溫下于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1”項條件下測定，測得各特征峰與內(nèi)標峰（五味子醇甲） 比值的相對保留時間、相對峰面積RSD 均小于2.0%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取供試品（S32） 粉末6 份，精密稱定，制備供試品溶液，在“2.1”項條件下測定，測得特征峰與內(nèi)標峰（五味子醇甲） 比值的相對保留時間、相對峰面積RSD 均小于2.0%，表明該方法重復性良好。

2.5 4 種木脂素類成分含有量測定［10-18］

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，置于1 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，在“2.1”項條件下測定。以峰面積為縱坐標（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X） 進行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5.2 精密度試驗 精密吸取供試品溶液（S32），在“2.1”項條件下連續(xù)測定6 次，測得各成分峰面積RSD 均小于1.5%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性試驗 精密吸取供試品溶液（S32），在“2.1”項條件下測定，測得各成分峰面積RSD均小于2.5%，表明該方法重復性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液（S32），室溫下于 0、2、4、8、10、12、16、24 h 在“2.1”項條件下測定6 次，測得各成分峰面積RSD 均小于3.0%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 取含有量已知的樣品（S32） 粉末約0.125 g，精密稱定，共9 份，以80%、100%、120%水平分別精密加入對照品溶液適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下測定，測得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素平均加樣回收率分別為97.35%、99.91%、101.05%、99.57%，RSD分別為1.54%、1.51%、1.35%、1.88%。

2.6 相對校正因子計算 精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.1”項條件下測定。以五味子醇甲為內(nèi)標，計算其他3 種成分的相對校正因子，見表3。

表3 各成分相對校正因子（五味子醇甲為內(nèi)標， n＝2）Tab.3 Relative correction factors of various constituents （schisandrin as an internal standard， n＝2）

2.7 耐用性考察 精密吸取對照品溶液，在不同儀器和色譜柱上各進樣10 μL測定，平行2 次，計算相對校正因子。結(jié)果，3 種成分相對校正因子的RSD 均小于2.0%，見表4。

表4 不同儀器、色譜柱上相對校正因子（n＝2）Tab.4 Relative correction factors on different instruments and columns （n＝2）

2.8 色譜峰定位 精密吸取對照品溶液，在不同儀器、色譜柱上各進樣10 μL 測定。以五味子醇甲為內(nèi)標，計算其他3 種成分的相對保留時間，結(jié)果見表5。

表5 不同儀器、色譜柱上相對保留時間（n＝2）Tab.5 Relative retention time on different instruments and columns （n＝2）

2.9 樣品含有量測定 取48 批樣品制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣10 μL 測定，分別采用一測多評法、外標法計算含有量。結(jié)果，2 種方法所得結(jié)果無顯著性差異（RSD＜5.0%），見表6。

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實驗比較了甲醇、乙腈等不同比例的流動相系統(tǒng)及不同類型的色譜柱，最終選用乙腈-水與Hypersil C18色譜柱 （250 mm ×4.6 mm，5 μm），各成分色譜峰分離度良好。為了使各成分均有較好響應，本實驗比較了不同檢測波長（220、254 nm），發(fā)現(xiàn)在254 nm 下色譜峰峰形較好，并且均有吸收，分離度理想。

表6 各成分含有量測定結(jié)果（%， n＝2）Tab.6 Results of content determination of various constituents （%， n＝2）

3.2 相似度分析 在各批醋五味子HPLC 特征圖譜中，五味子醇甲色譜峰分離度良好，峰面積較大，所以確定其作為參照峰。對48 批樣品的圖譜進行相似度評價，確認了16 個共有峰，相似度大于0.90；不同批樣品所含成分大致相同，但部分相似度較低，可能在含有量上有所差異，見表7。

表7 48 批樣品相似度Tab.7 Similarities of forty-eight batches of samples

3.3 相對校正因子耐用性 本實驗考察了不同儀器、色譜柱、柱溫（30、35、40 ℃）、體積流量（0.6、0.8、1.0、1.2 mL／min），發(fā)現(xiàn)它們對相對校正因子均無顯著影響，具有良好的耐用性。

3.4 結(jié)果分析 圖3、表6 顯示，不同市售醋五味子飲片中總木脂素含有量差異較大，可能與產(chǎn)地有關(guān)；不同產(chǎn)地五味子中各成分含有量不同，其炮制品中亦然，提示建立相關(guān)炮制規(guī)范的重要性。

圖3 48 批樣品含有量對比Fig.3 Content comparison of forty-eight batches of samples

定性的特征圖譜結(jié)合定量的一測多評簡便快捷，穩(wěn)定可靠，可在只消耗五味子醇甲對照品的情況下較全面地反映醋五味子其他成分信息，有助于提升飲片及其制劑的質(zhì)量控制水平。因此，建議在醋五味子標準項下增補特征圖譜，規(guī)定應穩(wěn)定地出現(xiàn)16 個特征峰，各峰之間具有相對穩(wěn)定的比例關(guān)系；一測多評法測得48 批醋五味子中4 種木脂素平均總含有量為1.04%，建議下調(diào)20%，即應不低于0.8%。

本研究基于特征圖譜和一測多評法的醋五味子質(zhì)量控制模式與現(xiàn)有國家標準相比，可反映各木脂素含有量控制水平，也能為進一步完善該炮制品的質(zhì)量標準提供依據(jù)。