于秀玲，白麗君，李 琳，姚雅芳，李 巖，許俊杰，楊文強

（臨沂大學(xué)，山東臨沂 276000）

茶藨子葉狀層菌Phylloporia ribis（Lonicera japonicaThunb.） 為銹革孔菌科葉狀層菌屬藥食兩用真菌，該菌常寄生于生長年限較長的忍冬藤植株上，資源分布廣泛，主產(chǎn)于山東、河南、湖南等忍冬藤種植區(qū)［1-2］，常用于治療咽炎、扁桃體炎、喉炎等上呼吸道感染疾病，臨床治療效果相當(dāng)顯著，也能夠有效提高機體免疫力［3］?，F(xiàn)代藥理研究表明，該菌提取物具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化等作用［4-5］。目前，從茶藨子葉狀層菌中分離鑒定的化學(xué)成分有甾醇類、萜類、有機酸、多糖等［6］，為進一步尋找其活性物質(zhì)，課題組對其進行了化學(xué)成分及抗病毒活性研究。采用多種色譜分離方法從中分離得到9 個化合物，其中6 個為首次從該菌中發(fā)現(xiàn)，并對1～8 進行了體外抗流感病毒（H1N1）、抗單純皰疹Ⅰ型病毒（HSV-1）、抗呼吸道合胞病毒（RSV A2） 活性測試。

1 材料

DRX-500M 核磁共振儀（瑞士布魯克公司）；安捷倫1200 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Thermo Scientific Q Exactive Focus 質(zhì)譜儀 （美國Thermo Fisher 公司）。硅膠薄層板、柱層析硅膠（青島海洋化工分廠）；聚糖凝膠Sephadex LH-20（上海安瑪西亞生物技術(shù)有限公司）。乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯，氯仿等試劑均為市售分析純。

茶藨子葉狀層菌采自山東省臨沂市平邑縣鄭城鎮(zhèn)金銀花種植區(qū)，經(jīng)山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基因測序與臨沂大學(xué)許俊杰教授鑒定為茶藨子葉狀層菌Phylloporia ribis（Lonicera japonicaThunb.）。呼吸道合胞病毒（RSV，A2 stain）、單純皰疹Ⅰ型病毒（HSV-1，F(xiàn) stain）、流感病毒（H1N1） 宿主細(xì)胞分別為人喉癌上皮細(xì)胞（HEp-2）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）、狗腎細(xì)胞（MDCK），由暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所提供，細(xì)胞生長在含10 %胎牛血清（FBS） 的DMEM 培養(yǎng)基中，維持液是含2%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基。

2 提取與分離

取茶藨子葉狀層菌10 kg，粉碎，75%乙醇回流提取3 次，每次1.5 h，過濾后合并濾液，減壓濃縮得總浸膏316.3 g，加水混懸后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，回收溶劑后得到石油醚萃取物76.5 g、乙酸乙酯萃取物33.2 g、水萃取物190 g。取乙酸乙酯萃取物進行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯（99∶1、95∶5、90∶10、8∶2、1∶1、3∶7） 梯度洗脫，TLC 薄層檢識，得到6 個餾分（Fr.1～Fr.6）。Fr.1 經(jīng)硅膠柱層析分離，得到化合物1 （1.2 g）；Fr.2、Fr.3 經(jīng)硅膠、Sephadex LH-20分離，得到化合物2 （81 mg）、3 （23 mg）；Fr.4經(jīng)硅膠、Sephadex LH-20 色譜分離，得到化合物4（42 mg）、5 （29 mg）、6 （17 mg）。取水萃取物15 g，經(jīng)ODS、Sephadex LH-20 色譜分離，得到化合物7 （53 mg）、8 （12 mg）、9 （8.1 g）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色針狀晶體（氯仿）；HR-ESIMSm／z：397.346 7 ［M ＋H］＋，分子式C28H44O（C28H45O 理論值397.346 5）。1H-NMR （500 MHz，CDCl3）δ：5.58 （1H，dd，J＝6.5，6.0 Hz，H-6），5.38～5.42 （1H，m，H-7），5.22 （1H，dd，J＝15.5，7.0 Hz，H-23），5.18 （1H，dd，J＝15.0，7.5 Hz，H-22），3.63～3.65 （1H，m，H-3），1.03 （3H，d，J＝7.0 Hz，H-21），0.94 （3H，s，H-19），0.92（3H，d，J＝7.0 Hz，H-28），0.84 （6H，d，J＝7.0 Hz，H-26，27），0.63 （3H，s，H-18）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：141.3 （C-8），139.8 （C-5），135.6 （C-22），132.0 （C-23），119.6 （C-6），116.3 （C-7），70.5 （C-3），55.8 （C-17），54.6（C-14），46.3 （C-9），42.9 （C-24），42.8 （C-13），40.8 （C-4），40.4 （C-20），39.1 （C-1），38.4 （C-12），37.0 （C-10），33.1 （C-25），32.0（C-2），28.3 （C-16），23.0 （C-15），21.1 （C-11），21.1 （C-21），20.0 （C-27），19.6 （C-26），17.6 （C-28），16.3 （C-19），12.0 （C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻 ［7］基本一致，故鑒定為 （3β，22E） -ergosta-5，7，22-trien-3-ol。

化合物2：白色固體 （氯仿）；HR-ESI-MSm／z：258.889 0 ［M-H］-，分子式 C7H4Cl4O2（C7H3Cl4O2理論值258.888 7）。1H-NMR （500 MHz，CDCl3）δ：5.93 （1H，s，1-OH），3.87 （3H，s，4-OCH3）；13C-NMR （125 MHz，CDCl3）δ：147.4（C-4），146.1 （C-1），127.3 （C-2，6），118.9（C-3，5），60.9 （4-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［8］基本一致，故鑒定為drosophilin A。

化合物3：無色晶體 （氯仿）；HR-ESI-MSm／z：197.080 8 ［M ＋H］＋，分子式 C10H12O4（C10H13O4理論值197.080 8）。1H-NMR （500 MHz，CDCl3）δ：14.02 （1H，s，-OH），6.06 （1H，d，J＝2.5 Hz，H-4），5.92 （1H，d，J＝2.5 Hz，H-7），3.85 （3H，s，6-OCH3），3.82 （3H，s，5-OCH3），2.61 （3H，s，2-CH3）；13C-NMR （125 MHz，CDCl3）δ：203.1 （C-1），167.5 （C-3），166.1 （C-5），162.9 （C-6），106.0 （C-2），93.5 （C-4），90.7（C-7），55.5 （5，6-OCH3），32.9 （2-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］基本一致，故鑒定為crototropone。

化合物4：橙黃色晶體（甲醇）；HR-ESI-MSm／z：179.070 2 ［M ＋H］＋，分子式 C10H10O3（C10H11O3理論值179.070 3）。1H-NMR （500 MHz，CH3OD）δ：7.52 （1H，d，J＝16.0 Hz，H-7），7.08 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），6.99 （1H，dd，J＝8.0，2.0 Hz，H-6），6.79 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.55 （1H，d，J＝16.0 Hz，H-8），2.33 （3H，s，H3-10）；13C-NMR （125 MHz，CH3OD）δ：201.6（C-9），150.0 （C-4），146.9 （C-5），146.8 （C-7），127.8 （C-1），124.7 （C-8），123.5 （C-2），116.6 （C-3），115.3 （C-6），27.0 （C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻［10］基本一致，故鑒定為（E） -3，4-二羥基苯亞甲基丙酮。

化合物5：白色固體 （甲醇）；HR-ESI-MSm／z：137.023 1 ［M-H］-，分子式 C7H6O3（C7H5O3理論值137.024 4）。1H-NMR （500 MHz，CH3OD）δ：9.69 （1H，s，-CHO），7.31 （1H，dd，J＝9.0，2.0 Hz，H-6），7.30 （1H，brs，H-2），6.91（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5）；13C-NMR （125 MHz，CH3OD）δ：193.1 （C-7），153.7 （C-4），147.2（C-3），130.8 （C-1），126.4 （C-6），116.2 （C-5），115.4 （C-2）。以上數(shù)據(jù)與文獻［11］基本一致，故鑒定為protocatechualdehyde。

化合物6：白色針晶 （甲醇）；HR-ESI-MSm／z：125.023 0 ［M-H］-，分子式 C6H6O3（C6H5O3理論值125.024 4）。1H-NMR （500 MHz，CH3OD）δ：7.43 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-3），7.42（1H，dd，J＝8.0，2.0 Hz，H-5），6.79 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-6）；13C-NMR （125 MHz，CH3OD）δ：151.5 （C-4），146.1 （C-2），141.9 （C-1），124.0（C-6），117.9 （C-5），115.9 （C-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］基本一致，故鑒定為1，2，4-苯三酚。

化合物7：白色固體 （甲醇）；HR-ESI-MSm／z：268.104 0 ［M ＋H］＋，分子式C10H13N5O4（C10H14N5O4理論值268.104 0）。1H-NMR （500 MHz，CH3OD）δ：8.31 （1H，s，H-8），8.18 （1H，s，H-2），5.97 （1H，d，J＝6.5 Hz，H-1′），4.74（1H，t，J＝6.5 Hz，H-2′），4.59 （2H，s，-NH2），4.33 （1H，dd，J＝5.0，2.5 Hz，H-3′），4.17 （1H，q，J＝2.5 Hz，H-4′），3.89 （1H，dd，J＝12.5，2.5 Hz，H-5′a），3.75 （1H，dd，J＝12.5，2.5 Hz，H-5′b）；13C-NMR （125 MHz，CH3OD）δ：157.6（C-6），153.5 （C-2），150.7 （C-4），142.0 （C-8），121.0 （C-5），91.2 （C-1′），88.17 （C-4′），75.5 （C-2′），72.7 （C-3′），63.5 （C-5′）。以上數(shù)據(jù)與文獻［13］基本一致，故鑒定為腺嘌呤核苷。

化合物8：白色固體 （甲醇）。1H-NMR （500 MHz，D2O）δ：7.90 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-6），5.94 （1H，d，J＝4.5 Hz，H-5′a），5.93 （1H，d，J＝8.5 Hz，H-5′b），4.38 （1H，t，J＝5.0 Hz，H-2），4.26 （1H，t，J＝5.0 Hz，H-3′a），4.15～4.17（1H，m，H-4），3.94 （1H，dd，J＝13.0，3.0 Hz，H-5），3.83 （1H，dd，J＝13.0，4.5 Hz，H-3′b）；13C-NMR （125 MHz，D2O）δ：166.2 （C-4），151.7 （C-2），141.9 （C-6），102.3 （C-5），89.4（C-1′），84.2 （C-4′），73.7 （C-3′），69.4 （C-2′），60.8 （C-5′）。以上數(shù)據(jù)與文獻［14］基本一致，故鑒定為尿嘧啶核苷。

化合物9：無色晶體 （水）。1H-NMR （500 MHz，DMSO）δ：4.88 （d，J＝3.5 Hz，1H），4.71（d，J＝5.0 Hz，1H），4.69 （d，J＝5.0 Hz，1H），4.53 （d，J＝6.0 Hz，1H），4.30 （t，J＝6.0 Hz，1H），3.64～3.66 （m，1H），3.54～3.58 （m，2H），3.45～3.49 （m，1H），3.22～3.26 （m，1H），3.11～3.16 （m，1H）；13C-NMR （125 MHz，DMSO）δ：93.1 （C-1），72.9 （C-3），72.4 （C-2），71.6 （C-5），70.1 （C-4），60.8 （C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻［15］基本一致，故鑒定為a-D-（＋） -葡萄糖。

4 抗病毒活性篩選

化合物對病毒宿主細(xì)胞的毒性實驗：將病毒宿主細(xì)胞以1×104／孔的濃度接種于96 孔板上，培養(yǎng)過夜形成單層細(xì)胞，培養(yǎng)液將化合物倍比稀釋至200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol／L，每個化合物3 個復(fù)孔，并設(shè)置不加藥物的細(xì)胞對照組，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后棄去培養(yǎng)基，每孔加入30 μL MTT 溶液，培養(yǎng)箱避光孵育4 h，隨后吸掉MTT，每孔加入200 μL DMSO 溶解生成的甲臜，并于搖板器上搖10 min，于酶標(biāo)儀570 nm下檢測光密度（OD），計算細(xì)胞存活率，公式為存活率＝OD加藥組／OD細(xì)胞對照組×100%。

化合物體外抗HSV-1、RSV、H1N1 的活性評價：3 種病毒宿主細(xì)胞以2×104細(xì)胞／孔的濃度接種于96 孔板上，培養(yǎng)過夜形成單層細(xì)胞，以化合物的最大無毒濃度作為起始濃度，含2%血清的培養(yǎng)基倍半稀釋成6 個濃度，每孔加入50 μL 化合物，隨后加入100TCID50的病毒混懸液50 μL，同時設(shè)置陽性對照組（HSV-1 用阿昔洛韋對照組，RSV、H1N1 用利巴韋林對照組）、病毒對照組和細(xì)胞對照組，每組3 個復(fù)孔。細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)病毒對照組出現(xiàn)“＋＋＋＋”（“-”表示無細(xì)胞病變，“＋”表示0～25%細(xì)胞發(fā)生病變，“＋＋”表示25%～50%細(xì)胞發(fā)生病變，“＋＋＋”表示50%～75%細(xì)胞發(fā)生病變，“＋＋＋＋”表示75%～100%細(xì)胞發(fā)生病變）、正常細(xì)胞對照組為正常時，記錄各孔的CPE，求出樣品對細(xì)胞病變的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

表1 顯示，茶藨子葉狀層菌75%乙醇提取物表現(xiàn)出顯著的抗RSV A2、H1N1 活性，其IC50分別為10、100 μg／mL，但未表現(xiàn)出良好的抗HSV-1 病毒活性（利巴韋林抗RSV、H1N1 活性IC50分別為6.3、25 μmol／L，阿昔洛韋抗HSV-1 活性IC50為1.6 μmol／L）；石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、水萃取物表現(xiàn)出抗RSV A2、H1N1 活性，其IC50分別為10、6、10、30、50 μg／mL及＞200 μg／mL。

表1 抗病毒實驗中各萃取物IC50值（μg／mL）Tab.1 IC50 values of various extracts in antiviral tests （μg／mL）

表2 顯示，化合物2 表現(xiàn)出抗RSV A2、HSV-1 活性，其IC50分別為50、75 μmol／L （利巴韋林抗RSV 活性IC50為6.3 μmol／L，阿昔洛韋抗HSV-1活性IC50為1.6 μmol／L）；化合物3 具有抗H1N1、RSVA2 的活性，其IC50分別為100、100 μmol／L（利巴韋林抗H1N1 活性IC50為25 μmol／L）；化合物4～5、7 表現(xiàn)出抗H1N1 活性，其IC50分別為12.5、12.5、25 μmol／L。

表2 抗病毒實驗中各化合物IC50值（μmol／L）Tab.2 IC50 values of various compounds in antiviral tests （μmol／L）

5 討論

本實驗對茶藨子葉狀層菌進行化學(xué)成分及抗病毒活性研究，其75% 乙醇提取物具有顯著的抗RSV A2、H1N1 活性，其 IC50分別為 10、100 μg／mL，但未表現(xiàn)出良好的抗HSV-1 病毒活性，從中分離鑒定了9 個化合物，其中6 個為首次從該菌中發(fā)現(xiàn)。采用CPE 抑制實驗對化合物進行了體外抗H1N1、抗HSV-1、抗RSV A2 活性研究，結(jié)果顯示化合物2 表現(xiàn)出抗RSV A2、HSV-1 活性，其IC50分別為50、75 μmol／L；化合物3 具有抗H1N1、RSV A2 的活性，其 IC50分別為100、100 μmol／L；化合物4～5、7 表現(xiàn)出較好的抗H1N1活性，其IC50分別為12.5、12.5、25 μmol／L，可知該菌具有顯著的抗RSV 病毒活性，從中分離的單體化合物也大多具有相同作用。本研究豐富了茶藨子葉狀層菌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對其深度開發(fā)與利用具有指導(dǎo)意義。