朱 淼，侯怡鈴，唐 賢，宋志強，丁 祥

（1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川南充 637009；2.西華師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川南充 637009）

T 細(xì)胞是起源于骨髓干細(xì)胞，在胸腺激素的作用下成熟分化于胸腺的一種免疫細(xì)胞，根據(jù)表面具有的CD4、CD8 分子將其分為CD4＋T 輔助淋巴細(xì)胞、CD8＋T 免疫淋巴細(xì)胞兩大亞類［1］，CD4＋亞類中的Th1 細(xì)胞（輔助性T 細(xì)胞1 型） 可以通過分泌細(xì)胞因子 （IFN-γ） 介導(dǎo)細(xì)胞免疫，Th2 細(xì)胞（輔助性T 細(xì)胞2 型） 則通過分泌IL-4 等細(xì)胞因子輔助B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體介導(dǎo)體液免疫；CD8＋亞群的T 細(xì)胞通過分泌穿孔素等物質(zhì)直接殺傷靶細(xì)胞，從而發(fā)揮其細(xì)胞免疫活性［2-3］。T 細(xì)胞能參與體液免疫和細(xì)胞免疫，在免疫調(diào)節(jié)中具有重要的作用。

真菌多糖是從真菌菌絲體、子實體和發(fā)酵液中提取的一種生物大分子，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎癥、抗腫瘤等活性，被認(rèn)為是最有效的免疫調(diào)節(jié)劑［4］。20 世紀(jì)50 年代，日本學(xué)者關(guān)于香菇多糖具有抗腫瘤活性的報道引起了研究人員的關(guān)注，越來越多的真菌多糖，如靈芝多糖、姬松茸多糖、香菇多糖已被證明具有顯著的免疫增強作用［5-7］。

松茸Tricholoma matsutake是口蘑屬外生菌根真菌，具有獨特的濃郁香味，為我國二級瀕危保護物種，也是世界上珍稀名貴的天然藥用菌，其多糖被認(rèn)為是有價值的藥物［8］。課題組前期從采自于四川馬爾康的松茸中提取出了一種結(jié)構(gòu)新穎的多糖TMP-A （圖1），能促進T 細(xì)胞（Jurkat 細(xì)胞株）的增殖［9］，但相關(guān)機制仍不清楚。因此，本實驗借助RNA-seq 測序技術(shù)將空白對照組、TMP-A 藥物組、LPS 陽性對照組的T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進行測序，分析TMP-A 藥物組相比于空白對照組的T 細(xì)胞差異表達(dá)基因（DEGs），探究誘導(dǎo)其增殖的基因及信號通路以確定相關(guān)機制。

1 材料

1.1 藥物 松茸Tricholoma matsutake采自四川省馬爾康市，保存于四川省南充市西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，其多糖（TMP-A） 按照參考文獻［10］報道的方法制備。

1.2 細(xì)胞株 T 細(xì)胞（Jurkat 細(xì)胞株） 購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生化與細(xì)胞所。

圖1 TMP-A 結(jié)構(gòu)Fig.1 TMP-A structure

1.3 試劑及儀器 RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、雙抗、Trizol 均購自美國Gibco 公司；脂多糖（LPS） 購自美國Sigma 公司；-80 ℃超低溫冰箱、3111 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、SE-CJ-IF 型超凈工作臺均購自美國Thermo scientific公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存于-80 ℃的T 細(xì)胞并培養(yǎng)，借助血球計數(shù)板配置細(xì)胞濃度為5×104／mL 的細(xì)胞懸液［9］，每孔1 mL 接種于6 孔培養(yǎng)板上，于5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在空白對照組中加入1 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，TMP-A 組每孔中加入1 mL TMP-A （細(xì)胞完全培養(yǎng)液配制，終質(zhì)量濃度10 μg／mL），LPS 陽性對照組中加入1 mL LPS溶液（終質(zhì)量濃度為10 μg／mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組3 個重復(fù)。將每孔中T 細(xì)胞保存于1 mL TRIzol 中。

2.2 樣品質(zhì)量檢測 將保存于TRIzol 中的T 細(xì)胞冷凍郵寄至諾禾致源公司，對其RNA 進行提取，并通過以下4 種方法對RNA 樣品進行檢測：（1）瓊脂凝膠電泳分析RNA 降解程度及是否有污染；（2） Nanodrop 檢測RNA 純度（OD260／OD280）；（3）Qubit 對RNA 濃度進行精確定量；（4） Aglient 2100 精確檢測RNA 完整性。樣品檢測合格后構(gòu)建cDNA 文庫，庫檢合格后上機測序。

2.3 數(shù)據(jù)處理 測序完成后，原始序列（Raw reads） 去除帶接頭、含有N （N 表示無法確定堿基信息） 大于10% 序列 （reads）、低質(zhì)量序列（reads） （Q phred ≤20 的堿基數(shù)占整個read 長度50%以上的reads），獲得用于后續(xù)分析的分析序列（Clean reads），借助HISAT 軟件［11］將其進行基因組定位分析，利用HTseq 軟件中的union 模型［12］進行基因表達(dá)分析；采用DESeq 軟件［13］進行差異基因表達(dá)的分析，借助GOseq［14］和KOBAS （2.0）［15］對差異基因進行GO 富集和KEGG 富集分析。

3 結(jié)果

3.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估 將測序得到的原始序列過濾后，空白對照組、TMP-A 組和LPS 陽性對照組分別得到46 574 489、50 259 600、57 439 600 條Clean reads，對應(yīng)的總大小分別為6.99、7.54、8.62 G。從表1 中可得出，堿基的測序錯誤率控制在0.02%，空白對照組、TMP-A 組、LPS 陽性對照組Q20 所占的比例分別為96.19%、95.87%、95.52%，Q30 分別為90.84%、90.25%、89.47%，而且GC 含有量在各樣本中基本保持不變。參考序列比對發(fā)現(xiàn)，每個組比對到基因組中的讀段數(shù)都超過了90%，見表2。

表1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估Tab.1 Quality assessment for sequencing data of transcriptome

表2 Clean reads 在參考基因組不同區(qū)域的分布Tab.2 Clean reads distribution in different regions of reference genome

3.2 基因表達(dá)分析 FPKM 大于60 的基因被認(rèn)為是高表達(dá)的，F(xiàn)PKM 在0～1 區(qū)間的基因被認(rèn)為是低表達(dá)或不表達(dá)。表3 顯示，3 組基因表達(dá)水平分布相似；空白對照組中有15 373 個基因表達(dá)，占總數(shù)的26.10%，2 803 個高表達(dá)（FPKM＞60），約占總數(shù)的4.77%；TMP-A 組有16 847 個基因表達(dá)，占總數(shù)的28.60%，2 822 個高表達(dá)，約占總數(shù)的4.79%；LPS 陽性對照組中有15 831 個基因表達(dá)，占總數(shù)的26.87%，2 819 個高表達(dá)，約占總數(shù)的4.79%。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，空白對照組、TMP-A 組、LPS 陽性對照組分別有9、10、5 個基因超高表達(dá)（FPKM＞2 000），空白對照組的為MT-CO2、MTCO3、Eef2、Actb、Calr、MT-CO1、Ptma、Eef1a1、MT-ATP6（表4），TMP-A 組的為MT-CO2、MT-CO3、Eef2、Actb、hnRNPA1、Calr、MT-CO1、Ptma、Eef1a1、MT-ATP6（表5），LPS 陽性對照組的為MT-CO1、MT-CO2、Eef2、Actb、Eef1a1（表6）。

表3 不同表達(dá)水平區(qū)間的基因數(shù)量統(tǒng)計［個（%）］Tab.3 Quantitative statistics of genes in different expression level intervals ［n （%）］

Eef1a1 為編碼真核翻譯延長因子的基因［16］，該基因在3 組中均呈高表達(dá)，說明T 細(xì)胞增殖過程中蛋白質(zhì)的合成增強。MT-CO1、MT-CO2、MTCO3 分別編碼細(xì)胞色素c 氧化酶的亞基Ⅰ、亞基Ⅱ、亞基Ⅲ，MT-ATP6 編碼的線粒體ATP 合酶是氧化磷酸化的關(guān)鍵酶，MT-CO1、MT-CO2、MTCO3、MT-ATP6 基因在空白對照組組、TMP-A 組超高表達(dá)，說明在TMP-A 的作用下氧化磷酸化所產(chǎn)生的能量仍然是T 細(xì)胞增殖過程的主要能量來源。Calr基因表達(dá)的鈣網(wǎng)蛋白能夠維持Ca2＋穩(wěn)態(tài)［17］，在空白對照組、TMP-A 組超高表達(dá)，提示在TMP-A 的作用下T 細(xì)胞在增殖過程中仍然主要是通過鈣網(wǎng)蛋白的高表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞運動、蛋白質(zhì)合成及線粒體代謝，協(xié)助蛋白質(zhì)的正確折疊以確保細(xì)胞的存活。hnRNP 家族的異質(zhì)性胞核核糖核蛋

白A1 基因（hnRNPA1）［18］僅在TMP-A 組高表達(dá)，提示TMP-A 具有增強RNA 代謝的功能。同時，Actb基因在TMP-A 組和LPS 陽性對照組的表達(dá)都低于空白對照組，Actb為β 肌動蛋白基因，能夠編碼肌動蛋白的形成［19］，提示T 細(xì)胞在TMP-A 和LPS 作用下細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞分裂活動具有相似的變化。

表4 空白對照組中基因的定量表達(dá)（FPKM＞2 000）Tab.4 Quantification of gene expressions in the blank control group （FPKM＞2 000）

表5 TMP-A 組中基因的定量表達(dá)（FPKM＞2 000）Tab.5 Quantification of gene expressions in the TMP-A group （FPKM＞2 000）

表6 LPS 陽性對照組中基因的定量表達(dá)（FPKM＞2 000）Tab.6 Quantification of gene expressions in the LPS positive control group （FPKM＞2 000）

3.3 差異基因表達(dá)分析 采用DESeq 進行差異基因（DEGs） 表達(dá)分析，以Pvalue ＜0.05 和fold change≥1 為差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，TMP-A 組相比于空白對照組有485 個基因顯著差異表達(dá)，482 個上調(diào)，3 個下調(diào)（圖2），其中差異倍數(shù)較大的10 個上調(diào)基因為Matk、Mlxipl、Zfr2、Ctrb1、Agxt、Exd3、Smtnl2、Entpd8、Crocc2、Sbk3（表7）；LPS 陽性對照組相比于空白對照組有1 512個基因顯著差異表達(dá)，1 441 個上調(diào)，71 個下調(diào)（圖3），其中差異倍數(shù)較大的10 個上調(diào)基因為Entpd8、Agxt、Matk、PPR18、Ctrb1、Exd3、Zfr2、Smtnl2、Sod3、Syt8 （表8）。

圖2 TMP-A 組相比于空白對照組基因差異表達(dá)分析火山圖Fig.2 Volcanic map analysis of DEGs of the TMP-A group vs the blank control group genes

表7 TMP-A 組相比于空白對照組差異基因的表達(dá)Tab.7 DEGs of the TMP-A group vs the blank control group

圖3 LPS 陽性對照組相比于空白對照組基因差異表達(dá)分析火山圖Fig.3 Volcanic map analysis of DEGs of the LPS positive control group vs the blank control group genes

進一步分析發(fā)現(xiàn)，Agxt，Entpd8，Exd3，Matk，Ctrb1，Zfr2，Smtnl2 在TMP-A、LPS 作用下都呈差異表達(dá)。Agxt為編碼丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的基因，能使乙醛酸轉(zhuǎn)化生成甘氨酸［20］，該基因表達(dá)上調(diào)，提示TMP-A、LPS 能夠通過增強甘氨酸的生成促進T 細(xì)胞的增殖，合成T 細(xì)胞參與免疫反應(yīng)需要的蛋白質(zhì)；核苷三磷酸二磷酰水解酶（NTPDASE） 家族的基因Entpd8 編碼的是一種與質(zhì)膜緊密結(jié)合的外酶［21］，能將三磷酸核苷和二磷酸核苷水解為單磷酸核苷，說明TMP-A、LPS 可通過增加體內(nèi)核苷酸／核苷的濃度來影響p2 受體的信號傳導(dǎo)。Exd3 為編碼包含3 的核酸外切酶3′-5′結(jié)構(gòu)域的基因［22］，提示TMP-A、LPS 通過上調(diào)該基因的表達(dá)確保DNA 復(fù)制的準(zhǔn)確性和催化DNA 延伸。Matk基因編碼CSK 激酶家族的巨核細(xì)胞相關(guān)酪氨酸激酶MATK［23］，該基因上調(diào)提示TMP-A、LPS 能抑制SRC 蛋白酪氨酸激酶的異常激活，調(diào)節(jié)依賴于SRC 蛋白酪氨酸激酶活性的RAF／MAPK通路的傳導(dǎo)?；騇lxipl、Crocc2、Sbk3 僅在TMP-A作用下呈差異表達(dá)，Mlxipl為編碼碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CHREBP） 的基因［24-25］，提示TMPA 能調(diào)節(jié)與葡萄糖和脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄?；騍yt8 僅在LPS 作用下呈差異表達(dá)，作為編碼突觸結(jié)合蛋白的成員之一［26］，它是Ca2＋感受器；與LPS作用機制不同，TMP-A 并不是通過突觸結(jié)合蛋白來調(diào)節(jié)T 細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和信號傳導(dǎo)過程，提示TMP-A、LPS 具有相似的誘導(dǎo)Jurkat 細(xì)胞增殖的機制，同時也存在一定的差異。

表8 LPS 陽性對照組相比于空白對照組差異基因的表達(dá)Tab.8 DEGs of the LPS positive control group vs the blank control group

3.4 差異基因GO 分析 GO 是在生物信息領(lǐng)域乃至整個生物領(lǐng)域中廣泛使用的分類系統(tǒng)，主要包括3 個分支，即細(xì)胞組分（Cellular Component）、分子功能（Molecular Funtion） 和生物過程（Biological Process）。將TMP-A 組相較于空白對照組的485 個差異基因進行GO 分析，結(jié)果有302 個在GO 中成功進行了注釋。然后以Corrected-Pvalue＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)進行篩選，得到在GO 中出現(xiàn)了富集的差異基因。在TMP-A 組的差異基因顯著富集到了66 條GO 基因門類中，包括多細(xì)胞有機體過程、離子轉(zhuǎn)運、離子跨膜運輸、肌肉系統(tǒng)過程、離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等36 條生物過程（Biological Process），細(xì)胞膜的組成等10 條細(xì)胞組分（Cellular Component），參與離子通道活性、跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性等20 條分子功能（Molecular Funtion）。同時，生物過程（Biological Process） 中的離子轉(zhuǎn)運和系統(tǒng)過程、細(xì)胞組分（Cellular Component） 中的細(xì)胞外周和質(zhì)膜、分子功能（Molecular Funtion） 中轉(zhuǎn)運活性是富集最顯著的GO 基因門類（圖4）。LPS 陽性對照組相較于空白對照組的差異基因GO 富集結(jié)果顯示，生物過程中的繁殖（reproduction） 是LPS 誘導(dǎo)T 細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因門類（圖5）。由此提示，與LPS 作用機制所涉及的關(guān)鍵基因門類不同，TMP-A 并不是通過影響其繁殖能力直接誘導(dǎo)T 細(xì)胞增殖。

3.5 差異基因KEGG 分析 KEGG 是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息數(shù)據(jù)庫，它有助于研究者把基因及表達(dá)信息作為一個整體網(wǎng)絡(luò)進行研究，本實驗借助它對TMP-A 組與空白對照組的差異基因富集通路進行分析。結(jié)果顯示，TMP-A、LPS 相比于空白對照組的差異基因都在代謝途徑、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、Ras 信號途徑、MAPK 信號途徑等多條通路中顯著富集（表9～10） 中。LPS 與空白對照組相比，差異基因還在cAMP 信號通路和鈣信號通路出現(xiàn)了富集，提示與LPS 不同，TMP-A 誘導(dǎo)T 細(xì)胞增殖的因素不涉及細(xì)胞內(nèi)第二信使。

圖4 TMP-A 相比于空白對照組差異基因GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of DEGs of the TMP-A group vs the blank control group

圖5 LPS 陽性對照組相比于空白對照組差異基因GO 富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of DEGs of the LPS positive control group vs the blank control group

Ras-Raf-Erk-MAPK 信號途徑是目前研究得比較清楚的一條信號通路，信號分子與受體結(jié)合后，經(jīng)下游一系列傳導(dǎo)過程將信號傳遞給靶基因，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生長和發(fā)育等生物學(xué)過程（圖6）。TMP-A 與空白對照組相比，富集在Ras-Raf-Erk-MAPK 信號途徑的差異基因均為上調(diào)基因（圖6 中邊框標(biāo)注），例如成纖維生長因子基因家族的Fgf2、Fgf3，磷脂酶A2 基因家族的Pla2g4f、Elk1等。LPS 相較于空白對照組，富集在Ras 信號通路的上調(diào)基因也包括Fgf2 和Pla2g4f等，但鈣調(diào)蛋白家族的基因Calml5 在該通路下調(diào)。TMP-A 組相比于空白對照組，上調(diào)的差異基因也在代謝途徑、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PI3K-Akt 信號通路中出現(xiàn)了富集，提示在TMP-A 作用下T 細(xì)胞中的生物代謝過程及信號傳導(dǎo)過程都得以增強。

表9 TMP-A 組與空白對照組差異基因KEGG pathway 富集分析Tab.9 KEGG pathway enrichment analysis of DEGS of the TMP-A group vs the blank control group

表10 LPS 陽性對照組與空白對照組差異基因KEGG pathway 富集分析Tab.10 KEGG pathway enrichment analysis of DEGS of the LPS positive control group vs the blank control group

4 討論

本研究以T 細(xì)胞（Jurkat 細(xì)胞株） 為研究對象，采用RNA-seq 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對松茸多糖（TMP-A） 組和空白對照組中的T 細(xì)胞進行測序并進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，氧化磷酸化是T細(xì)胞增殖過程中的主要能量來源，而且TMP-A 對T 細(xì)胞無毒性，不影響細(xì)胞的正常代謝。差異基因分析顯示，在TMP-A 的作用下，與T 細(xì)胞增殖的相關(guān)代謝過程明顯加強，而且生物過程（Biological Process） 中的離子轉(zhuǎn)運和系統(tǒng)過程、細(xì)胞組分（Cellular Component） 中的細(xì)胞外周和質(zhì)膜及分子功能（Molecular Funtion） 中的轉(zhuǎn)運活性是TMP-A促進T 細(xì)胞增殖的主要基因門類。同時，還篩選出了TMP-A 誘導(dǎo)T 細(xì)胞增殖的相關(guān)信號途徑，包括Ras 信號途徑、MAPK 信號途徑、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用、PI3K-Akt 信號途徑等。

圖6 Ras-Raf-Erk-MAPK 信號通路Fig.6 Ras-Raf-Erk-MAPK signaling pathway

MAPK 信號途徑是在真核細(xì)胞中存在的一種高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式，通過激活絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶Raf-1 （MAPKKK）、磷酸化MEK 蛋白激酶（MAPKK） 和MAPK （促分裂原活化蛋白激酶） 將有絲分裂信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，進而調(diào)控細(xì)胞的生長、分化和增殖等重要生理功能［27］。在Ras-Raf-Erk-MAPK 信號途徑中，成纖維生長因子家族基因的Fgf2［28］表達(dá)上調(diào)，提示TMP-A 對于維持骨髓微環(huán)境，調(diào)控細(xì)胞的分化具有重要作用；上調(diào)磷脂酶基因家族 PLA 中的Pla2g2e、Pla2g3［29-31］，表明TMP-A 能夠調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的新陳代謝、增強T 細(xì)胞參與炎癥和防御反應(yīng)的能力。Elk1 為ETS 轉(zhuǎn)錄因子ELK1 基因［32-34］，該基因表達(dá)上調(diào)，表明TMP-A 誘導(dǎo)下T 細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥相關(guān)因子IL-1β 和TNF-α 增多。Grin2b基因編碼的NR2B 是NMDA 受體（一種神經(jīng)遞質(zhì)通道） 的亞單位之一［35］，該基因表達(dá)上調(diào)，提示在TMP-A 作用下，T 細(xì)胞對刺激做出反應(yīng)的能力增強。綜上所述，TMP-A 通過上調(diào)成纖維生長因子家族（FGF）激活受體酪氨酸激酶RTK、下游Ras 蛋白，進而磷酸化MAPK 信號通路，提示它主要通過Ras-Raf-Erk-MAPK 信號途徑誘導(dǎo)T 細(xì)胞增殖。