喬翠霞，張新峰，程旭鋒，劉 琦，蔡小平*

（1.河南省中醫(yī)藥研究院，河南鄭州 450004； 2.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，河南鄭州 450008； 3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南鄭州 450000； 4.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州 450046）

據(jù)臨床統(tǒng)計(jì)，中晚期惡性腫瘤患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移高達(dá)70%左右，其中較為多見(jiàn)的腫瘤有晚期乳腺癌 （70%～80%）、中晚期前列腺癌 （70%～80%） 和晚期肺癌（10%～50%） 等［1-2］。腫瘤引起的骨轉(zhuǎn)移，往往會(huì)破壞骨質(zhì)，引發(fā)嚴(yán)重的骨不良事件，如難以忍受的骨痛、無(wú)誘因的發(fā)生病理性骨折、甚至脊髓壓迫等，均會(huì)嚴(yán)重影響其生存質(zhì)量，并給患者帶來(lái)精神及肉體上的極大創(chuàng)傷，大大加重腫瘤患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及口服止痛藥物帶來(lái)的副作用［3］。在我國(guó)，目前西醫(yī)臨床上針對(duì)惡性腫瘤發(fā)生明確的骨轉(zhuǎn)移后定期行雙磷酸鹽治療，合并局部微創(chuàng)手術(shù)、骨轉(zhuǎn)移灶放療、化療等多種手段必要時(shí)采用配合治療［4］。隨著近年來(lái)，中醫(yī)藥在腫瘤探索治療中的參與，中晚期腫瘤患者在發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后在選擇西醫(yī)療法的同時(shí)，常伴隨中醫(yī)藥辯證治療貫穿始終，往往能一定程度的提高臨床治療骨轉(zhuǎn)移的療效。馬錢(qián)子在中國(guó)古籍中記載具有鎮(zhèn)痛作用，可用于骨關(guān)節(jié)疼痛疾病治療［5-6］，有藥理研究表明其活性成分具有抗腫瘤、促進(jìn)骨損傷修復(fù)等作用［7-9］。本實(shí)驗(yàn)初步探討馬錢(qián)子治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛及骨質(zhì)損傷的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株 SPF 級(jí)雌性BALB ／c 小鼠共32 只，4周齡，體質(zhì)量（18±2） g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （滬） 2013-0016。人乳腺癌骨高轉(zhuǎn)移細(xì)胞MDA-MB-231BO，美國(guó)德克薩斯州立大學(xué)醫(yī)學(xué)系Toshiyuki Yoneda 博士惠贈(zèng)。

1.2 藥物 稱取馬錢(qián)子3.9 g，首先加入雙蒸水750 mL，藥物充分浸泡2 h，武火煮沸30 min，將藥液過(guò)濾，得第1次濾液；然后將藥渣再加雙蒸水500 mL，進(jìn)行武火煮沸30 min，再次將藥液過(guò)濾，得第2 次濾液；最后將2 次藥物的濾液合并在一起，采用80 ℃恒溫水浴，濃縮至500 mL，最終制成7.8 mg 生藥／mL，進(jìn)行滅菌后，將制備好的馬錢(qián)子藥液放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 戊巴比妥鈉（批號(hào)p3761） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；唑來(lái)膦酸注射液（4 mg／支，批號(hào)H20041346） 購(gòu)自江蘇省正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；注射器 （批號(hào)1306230） 購(gòu)自美國(guó)BD 公司；75% 乙醇（批號(hào)20160130）購(gòu)自鄭州吉爾康消毒制品有限公司。

1.4 儀器 醫(yī)學(xué)圖像采集系統(tǒng)購(gòu)自日本奧林巴斯株式會(huì)社；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 株式會(huì)社；Von Frey 細(xì)纖維購(gòu)自美國(guó)North Coast Medical 公司；BME-410C 自動(dòng)熱痛刺激儀購(gòu)自天津伯爾尼科技有限公司；十萬(wàn)分之一電子天平購(gòu)自瑞士Mettler-Toledo 公司。

2 方法

2.1 造模及給藥 乳腺癌小鼠骨轉(zhuǎn)移癌痛模型的建立參考文獻(xiàn)［10］方法，采用0.4% 戊巴比妥鈉將各組小鼠麻醉后，仰臥，75%乙醇對(duì)左后肢皮膚進(jìn)行消毒，在脛骨上部切一長(zhǎng)約0.5 cm 的切口，充分暴露左脛骨內(nèi)側(cè)面，在膝關(guān)節(jié)下方約5 mm 處沿脛骨長(zhǎng)軸，然后用23G 一次性無(wú)菌注射器針頭進(jìn)行打孔，針頭進(jìn)入骨髓腔，然后換上30 μL注射器進(jìn)入股骨骨髓腔，下一步緩慢注入20 μL 乳腺癌骨高轉(zhuǎn)移細(xì)胞MDA-MB-231BO 細(xì)胞（1.0×107／mL），注射完畢后用骨蠟封堵針孔，然后將肌肉和皮膚逐層縫合。假手術(shù)組采用同樣的方法在脛骨注入等體積的生理鹽水。將小鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、馬錢(qián)子組、唑來(lái)膦酸組，每組8 只。各組于術(shù)后第4 天開(kāi)始給藥［11］，假手術(shù)組、模型組和唑來(lái)膦酸組均給予0.2 mL 雙蒸水灌胃，馬錢(qián)子組給予78 mg／kg 馬錢(qián)子煎液灌胃，1 次／d，連續(xù)4 周；唑來(lái)膦酸組腹腔注射唑來(lái)膦酸0.2 mg／kg［12］，假手術(shù)組、模型組和馬錢(qián)子組均進(jìn)行腹腔注射生理鹽水0.5 mL，連續(xù)4 周，3次／周。

2.2 各組小鼠機(jī)械性痛覺(jué)超敏檢測(cè) 采用小鼠機(jī)械性痛覺(jué)超敏法［13］。在治療前后分別用2 g Von Frey 纖維刺激各組小鼠左后足底部，5～6 s 后觀察各組小鼠縮足反應(yīng)，記錄縮足次數(shù)。每只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)5 次，每2 次實(shí)驗(yàn)必須間隔3 min?？s足反應(yīng)率＝ ［（縮足次數(shù)／5）］×100%。

2.3 各組小鼠熱刺激痛覺(jué)過(guò)敏檢測(cè) 分別于治療前后評(píng)估小鼠熱刺激痛覺(jué)過(guò)敏［13］情況。將調(diào)節(jié)熱板儀溫度設(shè)置為（50±1）℃，然后將各組小鼠分別放置于熱板上，觀察各組小鼠的反應(yīng)，立即計(jì)時(shí)至小鼠開(kāi)始舔左后足時(shí)的時(shí)間，每次間隔15 min，每只測(cè)3 次，其均值為該小鼠的熱刺激痛閾值。

2.4 各組小鼠Micro-CT 檢測(cè) 按照前期報(bào)道［12］進(jìn)行。各組小鼠采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，分別取出左后脛骨，沿脛骨長(zhǎng)軸方向掃描脛骨近端，采用Micro-CT 掃描，掃描角度360 °、分辨率10 μm，獲取醫(yī)學(xué)顯微CT （μ-CT）圖像；在主機(jī)上選取生長(zhǎng)板下1 mm 和脛骨近端1.5 mm 的區(qū)域?yàn)槊舾袇^(qū)域（ROI），進(jìn)行三維圖像重建，最后采用機(jī)載軟件分析骨礦物質(zhì)密度（BMD）、骨體積（BV）、選取感興趣區(qū)域（ROI） 體積（TV），計(jì)算相對(duì)骨體積或骨體積分?jǐn)?shù)BV／TV。

2.5 各組骨轉(zhuǎn)移灶TRAP 染色觀察 按照前期報(bào)道［11-12］進(jìn)行。取各組小鼠骨轉(zhuǎn)移灶組織，采用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，行病理切片，TRAP 染色，觀察破骨細(xì)胞形態(tài)，并記錄TRAP 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（） 表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠縮足反應(yīng)百分率比較 與假手術(shù)組比較，模型組治療前、后小鼠縮足反應(yīng)百分率均升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，唑來(lái)膦酸組、馬錢(qián)子組治療后小鼠縮足反應(yīng)百分率均降低（P＜0.05，P＜0.01），而其治療前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與治療前比較，模型組治療后小鼠縮足反應(yīng)百分率升高（P＜0.01），唑來(lái)膦酸組、馬錢(qián)子組治療后小鼠縮足反應(yīng)百分率均降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠縮足反應(yīng)百分率比較（， n＝8）

表1 各組小鼠縮足反應(yīng)百分率比較（， n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與治療前比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.2 各組小鼠熱刺激痛閾值比較 與假手術(shù)組比較，模型組治療前、后小鼠熱刺激痛閾值均降低（P＜0.01）；與模型組比較，唑來(lái)膦酸組、馬錢(qián)子組治療后小鼠熱刺激痛閾值均升高（P＜0.01）；與治療前比較，唑來(lái)膦酸組、馬錢(qián)子組治療后均升高（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠熱刺激痛閾值比較（， n＝8）

表2 各組小鼠熱刺激痛閾值比較（， n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與治療前比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.3 各組小鼠左后脛骨轉(zhuǎn)移灶骨質(zhì)破壞情況 Micro-CT 掃描發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組小鼠無(wú)明顯骨質(zhì)破壞；其余各組均存在一定程度的骨質(zhì)破壞，BV／TV 值降低，BMD 下降；與假手術(shù)組比較，模型組骨質(zhì)破壞嚴(yán)重，BMD、BV／TV 值均下降（P＜0.01）；與模型組比較，唑來(lái)膦酸組、馬錢(qián)子組小鼠骨質(zhì)破壞均有所減輕，BMD 和BV／TV 值均升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖1、表3。

圖1 各組小鼠左脛骨三維Micro-CT 掃描圖

表3 各組小鼠BMD、BV／TV 比較（， n＝8）

表3 各組小鼠BMD、BV／TV 比較（， n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

3.4 各組小鼠骨轉(zhuǎn)移灶中TRAP （＋） 細(xì)胞數(shù)量比較 與假手術(shù)組比較，模型組TRAP （＋） 細(xì)胞數(shù)量增加 （P＜0.01）；與模型組比較，唑來(lái)膦酸組、馬錢(qián)子組TRAP （＋）細(xì)胞數(shù)量均減少（P＜0.01），見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠骨轉(zhuǎn)移灶中TRAP （＋） 細(xì)胞數(shù)量（，n＝8）

表4 各組小鼠骨轉(zhuǎn)移灶中TRAP （＋） 細(xì)胞數(shù)量（，n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

4 討論

中醫(yī)古籍里并無(wú)關(guān)于的腫瘤骨轉(zhuǎn)移病名記載，但就其癥狀可散見(jiàn)于中醫(yī)“脛陰疽”“骨蝕”“肉瘤”“石榴疽”“骨瘤”“骨痹”等范疇。早在《五十二病方》 已有骨睢（疽） 的記載?！端貑?wèn)·長(zhǎng)刺節(jié)論》：“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至名曰骨痹”，《華佗神醫(yī)秘傳》 記載骨質(zhì)腫瘤的臨床表現(xiàn)，“腫不變色，漫腫疼痛，堅(jiān)硬如石”，《醫(yī)宗金鑒》：“骨痹，則骨重酸疼不能舉也”，均是對(duì)骨轉(zhuǎn)移腫瘤特點(diǎn)的描述。本課題組認(rèn)為骨轉(zhuǎn)移日久可出現(xiàn)疼痛，成因與發(fā)展，主要在于陽(yáng)虛、痰凝兩個(gè)方面。其病機(jī)不外乎“不通則痛”“不榮則痛”。多為正氣虧虛，癌毒內(nèi)生所致?！鞍┒尽倍酁樘的站媚塾诠堑慕Y(jié)果。痰濁隨氣升降，流注臟腑經(jīng)絡(luò)，運(yùn)動(dòng)周身，無(wú)處不到，外而皮肉筋骨，痰濁與癌毒互結(jié)而成痰毒，痰毒流注于骨而形成骨轉(zhuǎn)移瘤，使經(jīng)絡(luò)壅塞不通、痰阻血瘀，從而引起機(jī)體疼痛；而痰瘀癌毒互結(jié)，耗傷正氣，皆可導(dǎo)致頑固、持久之癌痛。

正如《證治要訣》 云：“痛則不通，通則不痛”，腫瘤骨轉(zhuǎn)移患者往往因?yàn)樘禎崃髯⒀}、經(jīng)絡(luò)，阻礙氣血津液的運(yùn)行受阻而產(chǎn)生骨骼疼痛。

中藥馬錢(qián)子具有舒筋活血、散寒通絡(luò)、化痰散結(jié)、止痛的功效，針對(duì)痰毒流注病機(jī)，可多種原因?qū)е碌墓顷P(guān)節(jié)疾病的治療［5-6，14-15］。清代王維德在《外科全生集》 中謂馬錢(qián)子能“搜筋骨入骱之風(fēng)濕，祛皮里膜外凝結(jié)之痰毒”。張錫純?cè)凇夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》 中指出馬錢(qián)子具有“開(kāi)通經(jīng)絡(luò)，透達(dá)關(guān)節(jié)之力，遠(yuǎn)勝它藥”?，F(xiàn)代藥理研究也證實(shí)馬錢(qián)子可用于多種惡性腫瘤及疼痛的防治［7-8，16-17］。

機(jī)械性痛覺(jué)超敏、熱刺激痛覺(jué)過(guò)敏是目前評(píng)價(jià)生理性疼痛程度的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組治療后及本組治療前比較，馬錢(qián)子組治療后小鼠縮足反應(yīng)百分率均明顯升高，而熱刺激痛閾值均明顯降低，提示馬錢(qián)子能抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠觸誘發(fā)痛和熱刺激痛覺(jué)過(guò)敏，說(shuō)明馬錢(qián)子具有緩解骨轉(zhuǎn)移癌痛的作用。進(jìn)一步通過(guò)micro-CT 對(duì)各組小鼠的骨轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行掃描提示，模型組小鼠骨轉(zhuǎn)移灶的BV／TV 值偏低，BMD 下降，提示骨轉(zhuǎn)移灶中存在一定程度的骨質(zhì)流失，該結(jié)果與前期報(bào)道一致［11，13］，馬錢(qián)子可使小鼠骨轉(zhuǎn)移組織BV／TV 值及BMD 升高，提示其對(duì)骨轉(zhuǎn)移灶的骨質(zhì)流失具有一定的抑制作用。骨代謝依賴于破骨細(xì)胞介導(dǎo)骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)骨形成的動(dòng)態(tài)平衡，破骨細(xì)胞活性的相對(duì)增加可導(dǎo)致骨質(zhì)流失。TRAP 是破骨細(xì)胞的特征性酶，本實(shí)驗(yàn)中模型組骨轉(zhuǎn)移灶中TRAP （＋） 細(xì)胞明顯增多，提示骨轉(zhuǎn)移發(fā)生后破骨細(xì)胞過(guò)度激活，該結(jié)果與前期報(bào)道一致［11，13］，馬錢(qián)子組TRAP （＋） 細(xì)胞數(shù)量較模型組均明顯減少，提示馬錢(qián)子對(duì)破骨細(xì)胞具有一定的抑制作用。

綜上所述，馬錢(qián)子可以緩解骨轉(zhuǎn)移小鼠癌痛，其機(jī)理可能與其能抑制骨轉(zhuǎn)移灶中破骨細(xì)胞的活性，減少骨質(zhì)流失有關(guān)。