劉小娟，方月娟，夏道宗，王思為

（1.衢州市婦幼保健院，浙江衢州 324000； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053； 3.衢州市人民醫(yī)院，浙江衢州 324000）

常山胡柚是蕓香科柑橘屬植物柚與甜橙的雜交品種，主要產(chǎn)自浙江省衢州市常山縣，為我國特有品種［1］，其干燥未成熟果實(shí)于2016 年8 月以“衢枳殼”之名被納入2015 年版《浙江省中藥炮制規(guī)范》，可以作為中藥使用［2］，在2018 年3 月又被浙江省經(jīng)濟(jì)和信息化委員會列入“新浙八味”中藥材培育品種名單［3］。衢枳殼性微寒，味苦、辛、酸，具有寬胸理氣、止咳化痰、清熱解毒、抗氧化等功效，其主要成分是黃酮類、揮發(fā)性成分［4-6］，但目前對其報(bào)道較少［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)優(yōu)化衢枳殼總黃酮提取工藝，并研究其抗氧化活性，以期為該藥材開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 衢枳殼購于衢州南孔中藥有限公司，經(jīng)衢州市藥品食品檢驗(yàn)研究院宋劍鋒主任中藥師鑒定為正品。DPPH、ABTS 自由基購于美國Sigma-Aldrich 公司；蘆?。兌?5%） 對照品購于上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸購于廣東光華化學(xué)廠有限公司。冰醋酸、無水乙醇購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；5% NaNO2、10% Al （NO）3、NaOH 等均為分析純。

1.2 儀器 FA2004 型電子天平、752 型紫外分光光度計(jì)（上海菁海儀器有限公司）；KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Mill-Q 型去離子水制備系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含有量測定 參考文獻(xiàn)［8］報(bào)道。精密稱取95% 蘆丁對照品15.0 mg，置于100 mL量瓶中，乙醇溶解定容至0.15 mg／mL，精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 至另一量瓶中，30% 乙醇定容至5 mL，加入5% NaNO2溶液0.50 mL，振搖后靜置5 min，加入10%Al （NO3）3溶液0.30 mL，振搖后放置6 min，加入1.0 mol／mL NaOH 溶液2.0 mL，30%乙醇定容至10 mL，混合均勻，15 min 后在510 nm 波長處測定吸光度。以蘆丁含有量為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為A＝0.000 8X-0.008 1（R2＝0.999 1），在0～600 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

取衢枳殼適量，60 ℃下烘干后粉碎，過40 目篩，精密稱取10.00 g，加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇混合均勻后在適當(dāng)溫度下提取一段時(shí)間，靜置冷卻，濾過，置于50 mL 量瓶中，乙醇定容，得到供試品溶液，取1 mL，在510 nm 波長處測定吸光度，計(jì)算提取率，公式為提取率＝m1／M×100% （m1為總黃酮質(zhì)量，M為藥材質(zhì)量），其中m1＝供試液中總黃酮含有量×供試液體積×稀釋倍數(shù)。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 取5 g 衢枳殼，固定料液比為1∶20，在80 ℃下加入60%、65%、70%、75%、80%乙醇提取2 h，結(jié)果見圖1。由此可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%～75%范圍內(nèi)時(shí)總黃酮提取率隨著其升高而增加，在75% 時(shí)最高，為5.68%，但進(jìn)一步升高時(shí)提取率反而逐漸降低。因此，選擇70%、75%、80%進(jìn)行試驗(yàn)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

2.2.2 提取時(shí)間 取5 g 衢枳殼，加入60%乙醇，固定料液比為1∶20，在80 ℃下提取1、1.5、2、2.5、3 h，結(jié)果見圖2。由此可知，提取1～2 h 時(shí)總黃酮提取率升高不明顯；2 h 后提取率升高程度較快，在2.5 h 時(shí)最高，為4.74%；進(jìn)一步延長時(shí)提取率升高程度緩慢，甚至有下降趨勢，可能與溶劑對總黃酮的溶解達(dá)到飽和所致。因此，選擇2、2.5、3 h 進(jìn)行試驗(yàn)。

圖2 提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.2.3 料液比 取5 g 衢枳殼，加入60% 乙醇，在80 ℃下按料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30提取2 h，結(jié)果見圖3。由此可知，料液比在1∶10～1∶20 范圍內(nèi)時(shí)總黃酮提取率升高程度緩慢；增加至1∶25 時(shí)提取率最高，為4.61%；大于1∶25 時(shí)提取率略有上升，但程度不明顯。因此，選擇1∶20、1∶25、1∶30 進(jìn)行試驗(yàn)。

圖3 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.2.4 提取溫度 取5 g 衢枳殼，加入60%乙醇，固定料液比為1∶20，在60、65、70、75、80、85 ℃下提取2 h，結(jié)果見圖4。由此可知，初期隨著提取溫度增加，總黃酮提取率不斷升高，在75 ℃時(shí)最高；繼續(xù)增加時(shí)提取率不升反降，其原因可能是溫度過高導(dǎo)致總黃酮部分被破壞。因此，選擇70、75、80 ℃進(jìn)行試驗(yàn)。

圖4 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

2.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）、提取溫度（D） 作為影響因素，總黃酮提取率（Y）作為評價(jià)指標(biāo)［8］，采用L9（34） 正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)。因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

由此可知，各因素影響程度依次為料液比（C） ＞提取溫度（D） ＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（A） ＞提取時(shí)間（B），因素C對總黃酮提取率有顯著影響（P＜0.05），而其他3 種因素影響不顯著（P＞0.05）。結(jié)合表2 可知理論最佳組合為A3B1C3D3，但提取溫度對提取率無明顯影響，而且其過高會對總黃酮造成一定破壞，故選擇其為80 ℃ （D2）。最終確定，最優(yōu)工藝為料液比1∶30，提取溫度80 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時(shí)間2 h，總黃酮提取率為6.2%。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取2 g 衢枳殼，按“2.3”項(xiàng)下優(yōu)化工藝提取3 次，測得總黃酮提取率分別為6.19%、6.20%、6.23%，平均6.21%，與預(yù)測值6.2%接近，表明工藝穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。

2.5 體外抗氧化活性研究

2.5.1 清除DPPH 自由基 參考文獻(xiàn)［9-11］報(bào)道，并略作調(diào)整。精密稱取DPPH 自由基20 mg，250 mL 無水乙醇定容至2×10-4mol／L。取不同質(zhì)量濃度總黃酮溶液各2 mL，在同一具塞管中加入上述DPPH 溶液，振搖混勻，室溫避光條件下靜置30 min，以無水乙醇為對照，在517 nm 波長處測定其吸光度Aa；取上述DPPH 溶液與等體積（2 mL）無水乙醇的混合液，以及不同質(zhì)量濃度總黃酮溶液與等體積（2 mL） 無水乙醇的混合液，在517 nm 波長處分別測定吸光度Ac、Ab，計(jì)算清除率，公式為清除率＝ ｛ ［1-（Aa-Ab）］／Ac｝ ×100%，并求得IC50，通過Graphpad Prism6 軟件進(jìn)行處理，結(jié)果見圖5。由此可知，隨著總黃酮溶液質(zhì)量濃度升高，其清除DPPH 自由基的能力逐漸增強(qiáng)，在5～1 000 μg／mL 范圍內(nèi)的清除率由7.58%升至88.537%。

圖5 總黃酮對DPPH 自由基的清除能力Fig.5 Scavenging capacity of total flavonoids on DPPH free radical

2.5.2 清除ABTS 自由基 參考文獻(xiàn)［12］報(bào)道。將ABTS 自由基事先配成0.087 5 mmol／L 溶液，以0.4 mL 70%乙醇為對照品；取不同質(zhì)量濃度總黃酮溶液0.4 mL，移入3.6 mL 上述溶液中，渦旋混合后置于避光處，10 min 后在734 nm 波長處測定吸光度A734，計(jì)算清除率，公式為清除率＝ （1-樣品管A734／對照管A734） ×100%，并求得IC50，通過Graphpad Prism6 軟件進(jìn)行處理，結(jié)果見圖6。由此可知，總黃酮溶液質(zhì)量濃度在5～1 000 μg／mL 范圍內(nèi)時(shí)，對ABTS 自由基的清除率由6.236%升至99.054%，并且從250 μg／mL 開始與維生素C相當(dāng)。

圖6 總黃酮對ABTS 自由基的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of total flavonoids on ABTS free radical

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化衢枳殼總黃酮提取工藝，得到最佳參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶30，提取時(shí)間2.0 h，提取溫度80 ℃，總黃酮提取率達(dá)6.21%，而且該方法簡便快速，無污染，可避免浸出更多無效成分，有利于進(jìn)一步分離純化。優(yōu)化后，衢枳殼總黃酮提取液對ABTS 自由基的清除能力與維生素C 相當(dāng)，而對DPPH 自由基的清除率達(dá)88.537%，表明其體外抗氧化活性顯著，并呈量效依賴關(guān)系。

自從2015 年衢枳殼作為中藥被納入《浙江省中藥炮制規(guī)范》 以來，關(guān)于其有效成分及藥理作用的文獻(xiàn)有所增加［13-15］，但還是偏少，而相關(guān)研究可對該藥材種植、采栽、炮制方法的確定起到推動(dòng)作用，促進(jìn)浙江道地藥材資源的保護(hù)與開發(fā)，并能不斷鞏固和提高浙江中藥品牌的影響力。同時(shí)，該藥材的抗氧化活性能作為潛在抗氧劑應(yīng)用于食品和藥品中，從而為其綜合利用奠定理論基礎(chǔ)。

今后，課題組將進(jìn)一步研究衢枳殼總黃酮與抗氧化有關(guān)的藥理活性及其作用機(jī)制，如改善呼吸道炎癥反應(yīng)、哮喘等，以期將其開發(fā)成安全性高、療效確切的相關(guān)藥物。