安 莉,孫丕忠

1)四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室 成都 610000 2)青島市黃島區(qū)中醫(yī)醫(yī)院外一科 山東青島 266500

巨噬細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，不僅參與機(jī)體正常免疫過(guò)程，還與動(dòng)脈粥樣硬化等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生有關(guān)[1]。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是革蘭陰性菌的主要組成部分，可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路的激活，從而促進(jìn)炎癥因子的釋放和一氧化氮(nitric oxide，NO)的合成[2]。青蒿素是一種新型倍半萜內(nèi)脂化合物，具有抗炎、抑制血管生成、抗腫瘤等功效，可抑制巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子[3-4]。本實(shí)驗(yàn)觀察了青蒿素對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的激活及炎癥反應(yīng)的影響，為進(jìn)一步明確青蒿素的抗炎機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7購(gòu)自上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司；青蒿素購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司； TNF-α檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司， IL-1β檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司，NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司；Toll樣受體4(toll-like receptor-4，TLR4)抗體、誘導(dǎo)型NO合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam，IκB-α抗體、NF-κB p65抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology；LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma；細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、細(xì)胞核蛋白提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2細(xì)胞分組將Raw264.7細(xì)胞分成空白對(duì)照組、LPS組、青蒿素20 mg/L組、青蒿素40 mg/L組、青蒿素80 mg/L組[5-6]。LPS組細(xì)胞以含有LPS(1 mg/L)的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；青蒿素20、40、80 mg/L組細(xì)胞分別以含有LPS和20、40、80 mg/L青蒿素的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；空白對(duì)照組以不含LPS和青蒿素的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β、NO分泌量的檢測(cè)取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β含量；用Griess試劑法檢測(cè)培養(yǎng)上清中亞硝酸鹽含量，亞硝酸鹽含量可以間接反應(yīng)NO含量。均依照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.4巨噬細(xì)胞中TLR4、iNOS、IκB-α的檢測(cè)采用Western blot法檢測(cè)。取各組細(xì)胞接種到6孔板中，每孔加入100 μL蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量，加入5×Loading Buffer混合，于100 ℃水浴中煮沸5 min。用100 g/L分離膠、50 g/L濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE,蛋白上樣量為30 μg。分離膠中以160 V恒壓電泳，濃縮膠中90 V恒壓電泳。溴酚藍(lán)染料到達(dá)凝膠末端后，取出凝膠，轉(zhuǎn)膜(轉(zhuǎn)膜電壓100 V，時(shí)間50 min)，將NC膜置于抗體孵育袋中，分別與TLR4、iNOS、IκB-α一抗(1∶1 000稀釋)、HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000稀釋)反應(yīng)液雜交，HRP-ECL發(fā)光。用Image J圖像處理系統(tǒng)分析條帶灰度值，以β-actin作為參照。以目的條帶與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.5細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白的檢測(cè)采用Western blot法檢測(cè)。取各組細(xì)胞，分別提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核總蛋白，按照細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、細(xì)胞核蛋白提取試劑盒說(shuō)明操作，用Western blot法檢測(cè)NF-κB p65蛋白表達(dá)水平。NF-κB p65抗體以1∶1 000稀釋，步驟同1.4。細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白定量以Histone H作為內(nèi)參，細(xì)胞質(zhì)中以β-actin作為內(nèi)參。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS21.0分析，5組各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.15組巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β分泌量的比較見表1。與空白對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞TNF-α、IL-1β分泌量升高(P<0.05)。與LPS組比較，各青蒿素處理組細(xì)胞TNF-α、IL-1β分泌量降低(P<0.05)，并且青蒿素80 mg/L組TNF-α、IL-1β分泌量最低(P<0.05)。

表1 5組巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β分泌量的比較

2.25組巨噬細(xì)胞中NO分泌量和iNOS蛋白表達(dá)水平的比較見圖1和表2。與空白對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞NO分泌量及細(xì)胞中iNOS表達(dá)水平升高(P<0.05)。與LPS組比較，各青蒿素處理組細(xì)胞NO分泌量及細(xì)胞中iNOS表達(dá)水平降低(P<0.05)；并且青蒿素80 mg/L組變化最顯著(P<0.05)。

表2 5組巨噬細(xì)胞NO分泌量和iNOS表達(dá)水平的比較

2.35組巨噬細(xì)胞中IκB-α、TLR4蛋白表達(dá)水平的比較見圖1和表3。與空白對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)水平升高，IκB-α蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。與LPS組比較，各青蒿素處理組細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)水平降低，IκB-α蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；且青蒿素80 mg/L組細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)水平最低，IκB-α蛋白水平最高P<0.05)。

1：空白對(duì)照組；2：LPS組；3、4、5：青蒿素20、40、80 mg/L組

表3 5組巨噬細(xì)胞中IκB-α、TLR4蛋白表達(dá)水平的比較

2.45組巨噬細(xì)胞中NF-κB p65表達(dá)的比較見圖2、表4。與空白對(duì)照組比較，LPS組胞質(zhì)中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平降低，胞核中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與LPS組比較，各青蒿素處理組胞質(zhì)中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平升高，胞核中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；且青蒿素80 mg/L組的變化最顯著(P<0.05)。

1：空白對(duì)照組；2：LPS組；3、4、5：青蒿素20、40、80 mg/L組

表4 5組巨噬細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中NF-κB p65表達(dá)水平的比較

3 討論

炎癥是機(jī)體重要的病理過(guò)程，巨噬細(xì)胞是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要參與者。LPS是巨噬細(xì)胞重要的激活因子，可以直接誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放促炎因子[7]。TNF-α是炎癥反應(yīng)過(guò)程中的初級(jí)內(nèi)源性炎癥因子，IL-1β也是促炎因子，TNF-α、IL-1β被認(rèn)為是炎癥相關(guān)疾病進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)因子[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS處理后的小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β分泌量增加，說(shuō)明成功構(gòu)建了巨噬細(xì)胞炎癥模型。

青蒿素是一種抗瘧疾藥物，并且也具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、滑膜炎等炎性疾病損傷的作用，可以降低受損組織炎癥因子水平[5,9-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青蒿素可以逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為TNF-α、IL-1β分泌量下降，提示青蒿素具有抑制小鼠巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，青蒿素可以減少Ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中炎癥因子基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。TLR4-NF-κB通路是目前研究較為透徹的與炎癥有關(guān)的通路之一，TLR4是炎癥反應(yīng)的正向誘導(dǎo)因子，位于該通路的上游[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)青蒿素能夠降低LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)，抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位，促進(jìn)IκB-α蛋白表達(dá)，提示青蒿素抗炎機(jī)制可能與抑制巨噬細(xì)胞中TLR4-NF-κB通路激活，從而減少炎癥因子釋放有關(guān)。

NO具有重要的生理功能，其是在NO合酶催化作用下產(chǎn)生的小分子化合物。NO在人體內(nèi)一方面作為信號(hào)傳遞分子參與生命體的活動(dòng)，另一方面可以直接作用于染色體、細(xì)胞膜或其他細(xì)胞組分，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷[16-18]。iNOS在炎癥、腫瘤等病理?xiàng)l件下促進(jìn)NO合成，而NO過(guò)多則會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[19-20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)青蒿素處理可以下調(diào)LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞中iNOS蛋白的表達(dá)，減少NO的合成，這可能是青蒿素抗巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制之一。

總之，本研究以巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌為主要切入點(diǎn)，證實(shí)了青蒿素可以抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，并且初步證實(shí)青蒿素抗炎作用機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路激活及NO合成有關(guān)。