王 堯，巴宏軍，柳子川，周 旻

1)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)科 廣州 510095 2)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管兒科 廣州 510080

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近幾十年來全球的發(fā)病率明顯增加[1]。雖然整體治療效果較好，但仍有10%的患者預(yù)后極差，包括未分化、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌[2]。近年來，免疫檢查點抑制劑在多種腫瘤中取得了持久性療效[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤免疫細胞(tumor-infiltrating immune cells, TIICs)的數(shù)量和分布可影響腫瘤患者的治療反應(yīng)，TIICs成為進一步提高患者生存率的潛在藥物靶標。甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展與炎癥和免疫細胞浸潤高度相關(guān)，探索其免疫浸潤模式有助于判斷患者的預(yù)后和治療反應(yīng)[5]。CIBERSORT分析工具能夠利用標準化的基因表達數(shù)據(jù)估算不同腫瘤樣本中的細胞組成，具有分辨率高及可同時量化多種類型免疫細胞的優(yōu)勢，其優(yōu)越性能已在多種惡性腫瘤中得以驗證[6]。本研究中，我們使用CIBERSORT分析甲狀腺癌組織中TIICs的組成，并進一步探討其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)采集從癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas，TCGA)下載58例正常甲狀腺和448例甲狀腺癌患者的臨床資料。資料采集時間(即隨訪截止時間)為2019年8月31日。正常甲狀腺組織58例,男19例，女39例；年齡36～90(69.1±15.8)歲。甲狀腺癌組織448例，男117例，女331例；年齡34～86(67.3±14.7)歲；TNM分期Ⅰ期258例，Ⅱ期47例，Ⅲ期97例，Ⅳ期46例。

1.2正常甲狀腺和甲狀腺癌組織中TIICs組成的CIBERSORT評估采用CIBERSORT分析工具(https://cibersort.stanford.edu)推算正常甲狀腺和甲狀腺癌組織中22種免疫細胞的組成?；虮磉_數(shù)據(jù)集使用標準注釋文件編寫，然后上傳到CIBERSORT網(wǎng)站，利用白細胞特征矩陣(LM22)進行1 000次計算，使用蒙特卡羅抽樣為每個樣本的反褶積計算P值。

1.3免疫浸潤模式的聚類分析為了分析甲狀腺癌組織中免疫細胞比例與患者預(yù)后之間的關(guān)系，對所有樣本進行分層和聚類，以確定是否可以根據(jù)22種TIICs來識別免疫細胞浸潤模式。采用Ward方法對所有樣本數(shù)據(jù)按照免疫細胞組成比例的不同進行聚類。將22種免疫細胞的比例調(diào)整為0～1之間，采用Elbow法和Gap統(tǒng)計量相結(jié)合的方法，分析數(shù)據(jù)中不同聚類的可能數(shù)量，通過K-means聚類法選取最佳的聚類中心(k=2)并將樣本分為兩組。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用R軟件(3.5.2版本)進行數(shù)據(jù)分析。正常甲狀腺和甲狀腺癌組織中TIICs比例的比較采用兩獨立樣本的t檢驗；不同TNM分期甲狀腺癌組織中TIICs比例的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。總生存期(overall survival, OS)定義為自確診開始至任何原因引起死亡的時間間隔，通過Kaplan-Meier曲線分析TIICs與OS之間的關(guān)系，并采用log-rank法進行檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1正常甲狀腺和甲狀腺癌組織中TIICs的組成與比較結(jié)果見圖1。正常甲狀腺組織中含有豐富的未活化的記憶性CD4+T細胞[(23.10±2.30)%]、CD8+T細胞[(17.50±1.80)%]、M0巨噬細胞[(16.50±1.20)%]；活化的記憶性CD4+T細胞[(0.32±0.04)%]、活化的樹突狀細胞[(0.17±0.02)%]及中性粒細胞[(0.08±0.01)%]比例較低。甲狀腺癌組織中含有豐富的M0巨噬細胞[(19.50±2.10)%]、未活化的記憶性CD4+T細胞[(14.20±1.30)%]、CD8+T細胞[(11.20±1.40)%]和M2巨噬細胞[(10.80±1.70)%]；活化的肥大細胞[(0.05±0.01)%]、中性粒細胞[(0.03±0.01)%]和嗜酸性粒細胞[(0.02±0.01)%]的比例較低；未發(fā)現(xiàn)幼稚CD4+T細胞。與正常甲狀腺組織比較，甲狀腺癌組織中M0巨噬細胞、M2巨噬細胞、未活化的樹突狀細胞、活化的肥大細胞的比例較高，而CD8+T細胞、幼稚B細胞、濾泡輔助性T細胞的比例較低(圖2)。

圖1 正常甲狀腺和甲狀腺癌組織中22種TIICs的組成分布

圖2 正常甲狀腺與甲狀腺癌組織中TIICs組成的差異

2.2甲狀腺癌組織中TIICs與患者預(yù)后的關(guān)系甲狀腺患者低比例的活化的肥大細胞(χ2=5.471，P=0.021)、中性粒細胞(χ2=6.724，P=0.016)及高比例的CD8+T細胞(χ2=7.133，P=0.015)與較長的OS有關(guān)(圖3)。

圖3 甲狀腺癌組織中TIICs與患者預(yù)后的關(guān)系

隨著腫瘤分期的增加，活化的樹突狀細胞、M0巨噬細胞及單核細胞比例逐漸增加，而CD8+T細胞比例逐漸下降(表1)。其他類型的TIICs比例與患者預(yù)后及腫瘤分期無關(guān)。

表1 不同TNM分期甲狀腺癌組織中活化的樹突狀細胞、M0巨噬細胞、單核細胞、CD8+T細胞比例的比較%

2.3免疫狀態(tài)與甲狀腺癌預(yù)后的關(guān)系通過聚類分析將甲狀腺癌患者分為高免疫組(176例)和低免疫組(272例)，兩組中TIICs的分布情況見圖4A，Kaplan-Meier生存曲線見圖4B，高免疫組預(yù)后優(yōu)于低免疫組(χ2=3.653，P=0.039)。

A：兩組患者TIICs組成的分布；B：兩組患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程受宿主免疫系統(tǒng)的影響，在不同患者、腫瘤不同階段或不同類型腫瘤之間TIICs分布均顯著不同，通過對TIICs的數(shù)量、表型及空間分布進行評估可以為患者提供更加可靠的治療策略[7]。本研究通過分析TCGA的基因表達數(shù)據(jù)，明確TIICs在甲狀腺癌組織中的分布情況，并進一步分析TIICs與預(yù)后的關(guān)系。

腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages, TAMs)在不同病理亞型的甲狀腺癌組織中有明顯差異，高表達的TAMs與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤負荷和不良生存密切相關(guān)[8]。TAMs可通過分泌IL-8提高甲狀腺癌細胞的侵襲性[9]。本研究發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌組織中M0和M2巨噬細胞相對于正常組織明顯升高，提示它們在甲狀腺癌的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)M0巨噬細胞的比例隨著腫瘤分期而增加，這反映了腫瘤發(fā)展過程中TIICs亞群的功能異質(zhì)性，并提示M0巨噬細胞在甲狀腺癌的發(fā)展中具有重要作用，其有可能成為潛在的治療靶點。

鑒于腫瘤免疫特性而提出的“免疫評分”已成為判斷腫瘤預(yù)后的新方法，主要基于對T細胞亞群尤其是CD3+T細胞和CD8+T細胞的評估[10]。既往研究[11]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌組織中CD8+T和CD4+T細胞以及B細胞與縮小的腫瘤體積具有相關(guān)性，而腫瘤浸潤CD8+T細胞。本研究中發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌組織中存在豐富的CD8+T細胞，但相對于正常組織卻明顯降低，高水平的CD8+T細胞與延長的OS密切相關(guān)，并且隨腫瘤分期的增加CD8+T細胞比例逐漸下降。因此，我們認為CD8+T細胞對甲狀腺具有保護作用，是判斷患者預(yù)后的重要指標。

肥大細胞衍生介質(zhì)如趨化因子CXCL1、CXCL10和CXCL8等能夠促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，在甲狀腺癌組織中CXCL1和CXCL10能夠促進細胞增殖，CXCL8可誘導(dǎo)腫瘤的干細胞特性或增強上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。本研究發(fā)現(xiàn)低水平的活化的肥大細胞與延長的OS具有相關(guān)性。因此靶向肥大細胞或抑制細胞因子和趨化因子的治療有可能成為難治性甲狀腺癌的新方法。

綜上所述，本研究揭示了TIICs在甲狀腺癌與正常組織間的分布差異及其在判斷患者預(yù)后中的作用。TIICs在不同分期的甲狀腺癌組織中組成的多樣性表明免疫系統(tǒng)在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著復(fù)雜的作用。本研究將為臨床醫(yī)師在早期判斷預(yù)后及進一步制訂個體化的免疫治療方案提供幫助。