霍博，丁元鈞，蔡婧，張美霞

1.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院呼吸內科，陜西西安710032；2.空軍軍醫(yī)大學軍事生物醫(yī)學工程學系，陜西西安710032；3.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院護理部，陜西西安710032

前言

糖尿病是一種以機體葡萄糖代謝失衡為主要表現(xiàn)的代謝性的臨床疾病。全球約有超過4.2 億人飽受糖尿病折磨，而預期到2030年全球的糖尿病患者可能達到8 億多人。糖尿病主要包括1 型糖尿病和2型糖尿病兩類，其中2型糖尿病的患者人數(shù)占糖尿病總人數(shù)約90%。2 型糖尿病與遺傳學因素、生活方式和飲食結構改變等密切相關，多發(fā)生于中老年人群［1‐2］。隨著我國人口老齡化進程的加劇，2型糖尿病患者的人數(shù)也在逐年增加。2 型糖尿病潰瘍及創(chuàng)傷愈合困難問題一直是臨床上最為棘手的問題，嚴重影響著病患的生理和心理健康［3‐4］。而目前臨床上尚缺乏安全有效的加速2 型糖尿病組織損傷修復的治療方法。 低強度的脈沖電磁場（Pulsed Electromagnetic Fields,PEMF）作為一種安全、有效的物理治療方法，已于20 世紀80年代開始應用于臨床骨折及骨不連的治療［5］。近年來的臨床和動物實驗研究均發(fā)現(xiàn)，PEMF 能夠加速軟組織損傷的修復和愈合進程［6‐7］。也有研究發(fā)現(xiàn)，PEMF對于鏈脲佐菌素誘發(fā)的1 型糖尿病軟組織損傷修復具有積極效果［8‐9］。但是，PEMF 對于人口比例最大的2 型糖尿病軟組織損傷的作用效果如何國內外尚未見研究報道。在本研究中，通過使用瘦素受體缺陷誘導的自發(fā)型2型糖尿病db/db 小鼠，系統(tǒng)探究低強度PEMF 對于2 型糖尿病組織損傷修復的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑和儀器

3月齡雄性2 型糖尿病db/db 小鼠（C57BKS 背景，BKS.Cg‐m+/+Leprdb/J）及與其同背景的野生型小鼠（美國Jackson lab）；用于麻醉的戊巴比妥鈉緩沖液（美國Sigma 公司）；便攜式血糖儀（美國Johnson ＆Johnson 公司）；生物組織力學測試系統(tǒng)（東莞昆侖儀器有限公司）；數(shù)碼照相機（日本Canon公司）；組織切片機（德國Leica 公司）；高斯計（美國Lakeshore 公司）；ELISA試劑盒（武漢華美生物公司）；有機玻璃小鼠飼養(yǎng)籠（電磁場研究專用），課題組自制。

1.2 實驗設計和分組

本研究中涉及的動物實驗程序均由空軍軍醫(yī)大學動物倫理委員會授權批準。動物飼養(yǎng)于恒定溫度（23 ℃）、濕度（50%～60%）和12 h/12 h光‐暗循環(huán)的房間內。在整個實驗期間，所有動物均可隨意攝取干凈自來水和標準鼠糧。動物適應環(huán)境1周后，通過尾靜脈取血，使用血糖儀測量db/db 小鼠的隨機血糖值，血糖值高于16.7 mmol/L的小鼠被納入實驗。整個實驗分為3組，分別為Wild type野生型小鼠組（Wild type）、db/db小鼠組（db/db）及db/db施加以PEMF刺激組（db/db+PEMF），每組16只。分別于創(chuàng)傷模型構建的第5、12、19天處死每組的4只小鼠，每組剩余的4只小鼠于傷口完全愈合的時間點處死。全部3組小鼠均構建背部表皮創(chuàng)傷模型，僅db/db+PEMF組小鼠施加以全身的PEMF刺激，每天刺激2 h。

1.3 背部軟組織創(chuàng)傷模型的構建

使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，并用酒精刮除和清潔其背部。使用皮膚活檢針在每只小鼠的背部構建直徑為1 cm 的圓形傷口，充分分離皮膚、皮下組織和肌纖膜組織，并覆蓋Tegaderm 透明傷口敷料，以保持傷口濕潤。術后注射青鏈霉素合劑以防止感染的發(fā)生。

1.4 低強度PEMF發(fā)生裝置

PEMF 發(fā)生裝置為課題組自行研制，整個系統(tǒng)主要包括電磁信號發(fā)生器和3‐Helmholtz線圈系統(tǒng)兩部分。PEMF 波形脈沖群波形，頻率為15 Hz，該波形已在課題組的先前研究中廣泛使用，且其對于機體的積極作用效果也已被大量研究證實［10‐12］。3 個線圈（直徑80 cm）同軸放置，彼此相距30.4 cm，中心線圈和外部線圈的匝數(shù)分別為266 和500，該三線圈結構比兩個線圈的組裝具有更高的磁場均勻性［10］。塑料籠的底部與線圈的中心對齊，以確保小鼠位于電磁場的中心位置。使用高斯計測量線圈中的電磁場強度，線圈中的峰值磁場強度為2.0 mT，而背景電磁場為（50±2）μT。

1.5 傷口閉合率的檢測分析

使用數(shù)碼相機拍攝各時間點小鼠傷口。在拍攝照片前，動物被固定在觀察臺上，相機放置于觀察臺上方20 cm 處，數(shù)碼照片的水平和垂直分辨率分別為2 600 和2 000 像素。使用Matlab 軟件對傷口面積進行分析計算。利用顏色閾值、邊緣提取等多種圖像分析算法對目標信息進行識別和提取。傷口愈合率作為評價傷口愈合過程的標準，按以下公式表示：傷口愈合率=（第0 天的原始傷口面積‐第n 天的傷口面積）/第0天的原始傷口面積。

1.6 傷口組織抗張強度、傷口組織病理和ELISA 檢測分析

在每個時間點的動物處死后，組織樣本被切成3塊：一塊用于生物力學測試，一塊用于組織病理性檢測分析，另一塊用于ELISA 檢測。將用于評估傷口抗張強度的組織樣本修剪成8 mm×8 mm 的方形條帶。實驗前，將樣品浸泡在生理鹽水溶液中，以避免組織性能發(fā)生變化。采用生物力學材料測試系統(tǒng)進行組織拉伸實驗。皮膚條固定在張力計的兩個夾子之間，傷口部位位于兩個夾子的中線處。通過兩個夾鉗的20 mm/min移動，向條帶施加拉力。當觀察到試樣的最終破裂時，記錄最大斷裂載荷。組織學研究的傷口標本固定于10%中性福爾馬林中，隨后進行石蠟包埋，用鋸片切片機切割5 μm 厚的切片。切片脫皮復水，梅耶爾蘇木精伊紅染色，光學顯微鏡下觀察載玻片。ELISA 檢測使用武漢華美生物公司的ELISA 商業(yè)試劑盒，檢測指標分別為IL‐1β、TNF‐α、ⅤEGF 和IGF‐1，所有操作嚴格按照試劑盒的說明執(zhí)行。

1.7 統(tǒng)計學方法

使用Microsoft SPSS 22.0 計算機軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析（ANOⅤA）評估3 組之間的差異。一旦發(fā)現(xiàn)顯著性差異，采用確定Benferoni 檢驗確定兩組之間的差異顯著性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 低強度的全身PEMF 刺激對于db/db 小鼠血糖和體質量的影響

3組小鼠在組織創(chuàng)傷模型構建后的第5、12、19天的體質量和血糖水平如圖1所示。db/db 組和db/db+PEMF組小鼠的體質量值在術后的第5、12、19天均顯著高于Wild type 組小鼠（P＜0.01），但是db/db 組和db/db+PEMF 組小鼠的體質量值在各時間點均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。與Wild type 組小鼠相比，db/db組和db/db+PEMF組小鼠的血糖值在術后的第5、12、19 天均顯著升高（P＜0.01），但是db/db 組和db/db+PEMF 組小鼠的血糖值在各時間點均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結果顯示，低強度的全身PEMF 刺激并未對db/db小鼠的體質量和血糖產(chǎn)生顯著性影響。

圖1 PEMF刺激對于db/db小鼠血糖和體質量的影響Fig.1 Effects of pulsed electromagnetic field(PEMF)stimulation on blood glucose and body weight in db/db mice

2.2 低強度的全身PEMF 刺激對于db/db 小鼠傷口愈合速率和總愈合時間的影響

3組小鼠在組織創(chuàng)傷模型構建后的第5、12、19天的傷口愈合率以及傷口組織的創(chuàng)傷總愈合時間如圖2所示。結果顯示，2型糖尿病的db/db組在術后的第5、12、19 天的傷口愈合率均顯著低于Wild type 組（P＜0.01），而db/db+PEMF 組小鼠的傷口愈合率在術后的第5、12、19 天均顯著高于db/db 組（分別增加101.9%、47.1%和39.4%）。db/db 組的創(chuàng)傷總愈合時間相比于Wild type 組增加了74.2%，而PEMF 刺激顯著降低了db/db 小鼠的傷口總愈合時間（總愈合時間減少31.3%）。

2.3 低強度的全身PEMF 刺激對于db/db 小鼠傷口組織抗張強度的影響

3組小鼠在組織創(chuàng)傷模型構建后的第5、12、19天的傷口組織抗張強度如圖3所示。結果顯示，db/db組小鼠創(chuàng)傷組織的生物力學的抗張強度在術后的第5、12、19 天均顯著低于Wild type 組（P＜0.01），而db/db+PEMF 組小鼠的創(chuàng)傷組織的生物力學的抗張強度在術后的第5、12、19 天均顯著高于db/db 組（分別增加97.8%、58.3%和69.2%）。

2.4 低強度的全身PEMF 刺激對于db/db 小鼠傷口組織病理學的影響

3 組小鼠在組織創(chuàng)傷模型構建后的第12 天的傷口組織病理性結果如圖4所示。結果顯示，db/db 組小鼠的組織創(chuàng)傷位置在術后的第12天仍可見大量的炎性細胞聚集，而Wild type 組小鼠的組織創(chuàng)傷位置的炎性細胞數(shù)量較少。而經(jīng)過低強度的PEMF 治療12 d 后，db/db 小鼠的組織創(chuàng)傷位置的炎性細胞在術后12 d顯著減少。

圖2 PEMF刺激對于db/db小鼠傷口愈合速率和總愈合時間的影響Fig.2 Effects of PEMF stimulation on the wound healing rate and overall wound healing period in db/db mice

圖3 PEMF刺激對于db/db小鼠傷口組織抗張強度的影響Fig.3 Effects of PEMF stimulation on the wound tensile strength in db/db mice

2.5 低強度PEMF 刺激對于db/db 小鼠傷口組織中重要細胞因子表達的影響

3組小鼠在組織創(chuàng)傷模型構建后的第5、12、19天的傷口組織中重要細胞因子表達水平如圖5所示。ELISA 結果顯示，Wild type 組的炎癥相關因子IL‐1β和TNF‐α 的蛋白表達水平呈現(xiàn)出先增后減的變化趨勢（以第12天最高）。而db/db組的IL‐1β和TNF‐α的蛋白表達水平在術后的第5、12、19 天均顯著高于Wild type 組（P＜0.01）。而db/db+PEMF 組的IL‐1β 和TNF‐α 表達水平在術后的第5、12、19 天均顯著低于db/db 組（P＜0.05），并且db/db 組和db/db+PEMF 組的IL‐1β 和TNF‐α 的表達水平在術后的第5、12、19 天無統(tǒng)計學差異。ELISA 結果進一步顯示，db/db 組的ⅤEGF 和IGF‐1 的表達水平在術后的第5、12、19 天均顯著低于Wild type 組（P＜0.01），而db/db+PEMF 組的ⅤEGF 和IGF‐1 表達水平在術后的第5、12、19 天均顯著高于db/db組（P＜0.05）。

圖4 PEMF刺激對于db/db小鼠傷口組織病理學的影響（術后12 d，40倍鏡）Fig.4 Histopathological effects of PEMF stimulation on the wound tissues in db/db mice (on the 12nd day postoperatively,with 40×objective)

3 討論

3.1 PEMF 顯著改善db/db 小鼠創(chuàng)傷愈合能力，且與其對糖尿病體征的影響無關

圖5 通過ELISA檢測PEMF對db/db小鼠傷口組織中重要細胞因子表達的影響Fig.5 Effects of PEMF stimulation on the expressions of critical cytokines in the wound tissues in db/db mice based on ELISA assay

目前糖尿病軟組織損傷的動物實驗大多使用腹腔注射鏈脲佐菌素的方式構建糖尿病動物模型，但是該方法構建的糖尿病模型為典型的1 型糖尿病體征。在本研究中使用db/db小鼠作為2型糖尿病動物模型。db/db 小鼠是一種全身性瘦素受體缺陷小鼠，表現(xiàn)為攝食過度、肥胖、高血糖和高胰島素血癥等典型的2 型糖尿病體征。db/db 小鼠也是目前研究2 型糖尿病及其相關并發(fā)癥（如心血管疾病、腎病、神經(jīng)病變、骨骼肌病變、潰瘍等）最為理想的動物模型［13‐14］。

本文研究發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病的db/db 小鼠相比于非糖尿病小鼠在軟組織損傷模型構建的第5、12、19天表現(xiàn)出傷口愈合修復的顯著延遲，并且db/db 小鼠的創(chuàng)傷總愈合時間也相比于非糖尿病小鼠顯著延長。上述特征與臨床上的2 型糖尿病患者的軟組織創(chuàng)傷愈合特征相似。本研究也進一步揭示，低強度的PEMF 刺激從術后的第5 天開始即顯著加速了db/db小鼠軟組織創(chuàng)傷的修復進程，使2型糖尿病的創(chuàng)傷修復速率進程與非糖尿病小鼠類似，并且PEMF 將2型糖尿病小鼠的創(chuàng)傷總愈合時間縮短約30%。同時研究也發(fā)現(xiàn)，在治療的全過程中PEMF 并未對db/db小鼠的血糖和體質量產(chǎn)生顯著影響，提示PEMF 對2型糖尿病動物軟組織損傷的修復效應與其對糖尿病體征的影響無關。

3.2 PEMF 改善db/db 小鼠軟組織抗張強度，揭示了對膠原結構的潛在優(yōu)化效應

軟組織的抗張強度是評價傷口愈合的重要生物力學指標，能夠反映新合成和沉積的膠原蛋白的數(shù)量、質量和排列結構特性［15］。在傷口愈合過程中，隨著組織的持續(xù)修復，皮膚的抗張強度會逐漸增加。本研究的生物力學檢測結果表明，2 型糖尿病大鼠在整個創(chuàng)面愈合全過程中，其軟組織的抗張強度明顯低于正常大鼠。先前的動物實驗研究也報道了類似的實驗結果［16］。更重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)低強度的PEMF刺激在軟組織損傷模型構建的第5、12、19天均顯著提升了db/db 小鼠軟組織的生物力學抗張強度。研究表明，PEMF 對于提升2 型糖尿病動物的膠原纖維數(shù)量、加速膠原纖維沉積、促進膠原纖維的排布和定位具有積極效應，從而有助于改善2型糖尿病軟組織的修復速率和修復質量。

3.3 PEMF 抑制db/db 小鼠傷口組織炎性因子表達、促進血管新生細胞因子表達

傷口愈合是一個系列化的復雜事件，涉及到成纖維細胞、內皮細胞、角質細胞、炎性細胞和細胞外基質之間的合作和相互作用［17］。組織病理學染色結果顯示，2 型糖尿病db/db 小鼠在組織損傷的修復進程中（術后12 d）其炎性細胞數(shù)量顯著多于非糖尿病小鼠。本研究發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病小鼠在軟組織創(chuàng)傷后的炎癥反應相比于非糖尿病小鼠更為嚴重，而這種更為劇烈的炎性反應也會進一步阻礙軟組織的創(chuàng)傷修復進程。ELISA 結果也進一步揭示了2 型糖尿病db/db 小鼠損傷軟組織中促炎性因子IL‐1β 和TNF‐α的表達在術后的第5、12、19 天相比于非糖尿病小鼠均顯著增加。而組織病理性結果和ELISA 結果均揭示，低強度的PEMF刺激在組織創(chuàng)傷愈合的各階段均能夠抑制2型糖尿病小鼠的過度炎性反應，從而在促進db/db小鼠的組織損傷愈合中發(fā)揮積極效應。

血管內皮生長因子ⅤEGF 是一種組織創(chuàng)傷愈合的重要細胞因子，它參與血管生成并使毛細血管通透性增加，能夠反映創(chuàng)傷修復過程中的血管再生情況［18］。ELISA 結果顯示，db/db 小鼠損傷軟組織中的ⅤEGF表達水平在術后的第5、12、19天均顯著低于正常小鼠，提示2型糖尿病破壞了組織損傷修復過程中的血管再生能力。而PEMF刺激在術后的第5、12、19天均顯著增加了db/db 小鼠損傷組織中的ⅤEGF 表達，提示PEMF具有顯著的促新生血管再生潛能。其次，胰島素樣生長因子IGF‐1 作為機體中最重要的促組織生長和修復因子，而IGF‐1 同樣具有促血管再生的作用［19］。筆者同樣發(fā)現(xiàn)其在db/db 小鼠損傷軟組織中表達顯著降低。而本研究也發(fā)現(xiàn)，PEMF 治療在術后的第5、12、19 天均能夠顯著提升2 型糖尿病小鼠軟組織中的IGF‐1 表達，進一步證實PEMF 的促組織再生和促血管新生的潛能。

3.4 結論

綜上所述，本研究首次揭示了低強度PEMF能夠顯著加速2型糖尿病db/db小鼠的軟組織修復速率并改善組織的生物力學彈性屬性，這一效應可能與PEMF 的抗炎性反應及促血管再生具有密切關系。本研究結果提示，低強度PEMF 作為一種安全、經(jīng)濟的物理作用方式，有望成為臨床治療2型糖尿病組織創(chuàng)傷愈合困難這一棘手問題的新治療手段。