杜春書 王軍 黃佩花 吳多省 陳夢飛

心力衰竭(簡稱心衰)是各種器質(zhì)性心血管疾病的終末期階段，血流負荷過重或由心肌梗死引起心臟重構(gòu)是心衰的主要病理生理基礎(chǔ)[1]。既往研究證實，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1介導(dǎo)的信號通路自心肌代償性肥大至心衰發(fā)生各階段均發(fā)揮重要作用[2]。近年來，隨著分子生物學(xué)的研究進展，微小RNA(miRNA，miR)在心衰發(fā)生、發(fā)展過程中的作用越來越受到重視[3]。Espinosa-Diez等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-433通過反饋性放大TGF-β1/Smad3-Azin1信號通路促進腎臟纖維化。我們通過分析擴張型心肌病(DCM)合并慢性心衰(CHF)患者血清miR-433和TGF-β1水平變化及其與心功能的相關(guān)性，旨在為miR-433和TGF-β1在心衰發(fā)生、發(fā)展中的作用機制研究提供理論依據(jù)。

對象與方法

1.對象：2017年8月～2019年2月于海南省東方市東方醫(yī)院和海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科確診并接受治療的DCM合并CHF患者106例(DCM合并CHF組)，其中男67例，女39例，年齡37～81歲，平均年齡(62.1±12.0)歲，紐約心臟病學(xué)會(NYHA)心功能Ⅱ級33例，Ⅲ級47例，Ⅳ級26例。同時選取100例健康體檢者作為對照組，其中男60例，女40例，年齡34～80歲，平均年齡(60.3±13.5)歲。納入標準：(1)符合《中國心肌病診斷與治療建議》[5]關(guān)于DCM的診斷標準[心臟擴大：左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)>5.5cm(男性)或>5.0cm(女性)；左心室射血分數(shù)(LVEF)<45%]；(2)符合歐洲心臟病學(xué)會關(guān)于CHF的診斷標準[6]；(3)NYHA心功能分級Ⅱ～Ⅳ級[7]；(4)有明確的基礎(chǔ)心臟病史。排除縮窄性心肌炎、心包炎、家族性DCM、自身免疫性疾病、慢性阻塞性肺疾病、嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤、急慢性感染、外傷及長期大量吸煙、飲酒、濫用藥物者。本研究經(jīng)海南省東方市東方醫(yī)院和海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準，所有受試者均簽署知情同意書。

2.方法

(1)血清miR-433水平檢測：采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測血清miR-433水平。抽取兩組受試者空腹肘靜脈血2 ml,加入乙二胺四乙酸抗凝，離心取上清液，采用Trizol and miRNeasy mini試劑盒(德國Qiagen公司)提取總RNA，并對其進行質(zhì)檢，若A260 nm/A280 nm為1.8～2.1，則質(zhì)檢合格。采用miScript Ⅱ RT kit(50)(德國Qiagen公司)和SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(中國TaKaRa公司)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。miR-433莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物(上海生工生物工程有限公司)序列為5’-CGT GGT GAA CCT CCG TTT TAC CCG GTC TAA TGA GGA GGG CCC TAT GTC GAA TCC CCC GAT GGG -3’；miR-433擴增上游引物為5’-GTA CGG GCA AAT AAC CCC CGA GTC GC-3 ’，下游引物為5 ’-CCT GCC GTA TGG GTA CGT GCC AT-3’，以小分子U6作為內(nèi)參，反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s共45個循環(huán)。以2表示miR-433相對表達水平。

(2)血清TGF-β1水平檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測兩組受試者血清TGF-β1水平，ELISA試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司。

(3)生化指標檢測：采用Cobas e411全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(瑞士羅氏)檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、氨基末端B型鈉尿肽前體(NT-proBNP)等。采用葡萄糖氧化酶法檢測空腹血糖(FPG)和餐后2 h血糖(2 h PG)。

結(jié) 果

1.兩組受試者一般資料和臨床資料比較：兩組受試者性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史及FPG、2 h PG、HbA1c、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而DCM合并CHF組患者血清miR-433和TGF-β1水平均高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組受試者一般資料和臨床資料比較

2.DCM合并CHF組患者血清miR-433與TGF-β1水平的相關(guān)性分析：Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，DCM合并CHF組患者血清miR-433與TGF-β1水平呈正相關(guān)(r=0.302，P<0.001)，見圖1。

圖1 DCM合并CHF組患者血清miR-433與TGF-β1水平的相關(guān)性分析

3.不同NYHA心功能分級的DCM合并CHF患者血清miR-433、TGF-β1、NT-proBNP水平及LVEF、LVEDd比較：NYHA心功能Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級的DCM合并CHF患者血清miR-433、TGF-β1、NT-proBNP水平及LVEF、LVEDd比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著NYHA心功能分級的增加，其血清miR-433、TGF-β1、NT-proBNP水平及LVEDd逐漸升高，LVEF逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同NYHA心功能分級的DCM合并CHF患者血清miR-433、TGF-β1、NT-proBNP水平及LVEF、LVEDd比較

4.DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1水平與心功能的相關(guān)性分析：Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1水平均與NYHA心功能分級呈正相關(guān)(rs=0.576、0.473，P均<0.001)。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1水平均與NT-proBNP(r=0.455、0.410，P均<0.001)、LVEDd(r=0.388、0.372，P均<0.001)呈正相關(guān)；而血清miR-433和TGF-β1水平與LVEF呈負相關(guān)(r=-0.420、-0.365，P均<0.001)。

5.DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1與心功能分級的關(guān)系：將NYHA心功能分級(Ⅲ～Ⅳ級)作為因變量，賦值為1，分別將血清miR-433和TGF-β1水平以連續(xù)變量納入logistic回歸方程，未校正混雜因素時，血清miR-433和TGF-β1均是DCM合并CHF患者NYHA心功能分級進展的影響因素(P<0.05)；校正各項混雜因素后，血清miR-433和TGF-β1仍是DCM合并CHF患者心功能損傷加重的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1與心功能分級關(guān)系的多因素logistic回歸分析

討 論

DCM以心室異常擴張、心室壁變薄、心肌纖維化等為主要病理表現(xiàn)。根據(jù)指南推薦，DCM的治療原則為阻止或延緩心肌損傷進程[8]，因此，亟需針對心肌纖維化和心室重構(gòu)的研究。Cho等[9]的研究結(jié)果顯示，TGF-β1可促進心肌成纖維細胞活化并向肌成纖維細胞分化，進而導(dǎo)致細胞外基質(zhì)大量沉積。Chen等[10]的研究結(jié)果顯示，通過抑制大鼠TGF-β1基因表達后，心臟TGF-β1水平明顯降低，進而抑制其心室重構(gòu)，延緩心衰的發(fā)生，因此推測TGF-β1及其調(diào)控通路有望成為抗心肌纖維化治療的重要靶點之一。但Heldin等[11]卻發(fā)現(xiàn)抑制TGF-β1表達雖能抑制心肌纖維化，改善心肌細胞功能，但卻加劇了左心室擴張和炎癥反應(yīng)，因此，TGF-β1在心衰不同的發(fā)展階段可能發(fā)揮著不同作用，針對TGF-β1的抑制劑用于心衰的治療尚存在爭議。

心臟中的TGF-β1主要是由心臟成纖維細胞和肌成纖維細胞分泌，TGF-β1反過來又可促進成纖維細胞向肌成纖維細胞分化。既往有研究證實，在心肌細胞中轉(zhuǎn)染特定的miRNA可改善或損傷心肌功能，影響心力衰竭的進程。李軍等[12]的研究結(jié)果顯示，敲除小鼠miR-1252基因表達后，其心肌纖維化程度明顯加重，同時TGF-β1表達水平升高。而史曉婧等[13]的研究證實，轉(zhuǎn)染miR-808后，大鼠成纖維細胞TGF-β1水平明顯降低，進而改善心肌梗死后心肌纖維化的程度。miR-433定位于12號染色體，在腫瘤領(lǐng)域中的研究較為深入。陶麗嬋等[14]通過建立DCM小鼠模型，發(fā)現(xiàn)其miR-433表達水平明顯升高。Li等[15]發(fā)現(xiàn)miR-433在纖維化腎臟組織中的表達水平明顯上調(diào)，隨后證實miR-433可能通過促進TGF-β1/Smad3信號通路激活進而促進腎臟纖維化進程。

本研究結(jié)果顯示，DCM合并CHF患者血清miR-433水平高于對照組，且與TGF-β1水平呈正相關(guān)。目前對于CHF的診斷和分層主要依據(jù)心臟超聲、腦鈉肽、NT-proBNP、心肌損傷標志物等，除此以外，近幾年陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些炎癥類(如白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α)或代謝類(如胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-7)心肌功能生物標志物，但提供的信息均有限，尚未發(fā)現(xiàn)可反映心衰進展和心肌纖維化程度的標志物，因此，從miRNA水平探索新的標志物對于臨床精準治療具有重要價值。本研究中，隨著NYHA心功能分級的增加，DCM合并CHF患者血清miR-433、TGF-β1、NT-proBNP水平及LVEDd逐漸升高，LVEF逐漸降低，提示miR-433在DCM合并CHF的發(fā)生及病情進展過程中發(fā)揮重要作用，且血清miR-433與TGF-β1水平呈正相關(guān)，表明二者之間可能存在某種調(diào)控關(guān)系；同時血清miR-433、TGF-β1水平均與NT-proBNP、LVEDd、LVEF密切相關(guān)，表明在DCM合并CHF患者中，miR-433也可能參與心肌纖維化和心室重構(gòu)；多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，校正各項混雜因素后，血清miR-433和TGF-β1均為DCM合并CHF患者心功能損傷加重的獨立危險因素。

綜上所述，DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1水平均高于正常對照者，且均與NYHA心功能分級呈正相關(guān)，同時miR-433和TGF-β1也存在一定聯(lián)系，但其具體機制尚未明確，血清miR-433和TGF-β1是否可用于心衰的危險分層、作為潛在心衰的治療靶點仍需進一步探討。