劉士煌，鄭添予，朱奕霏，吳保義，張 燕，金春梅，于龍政

延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000

牛東方泰勒蟲病是由泰勒科、泰勒屬的東方泰勒蟲寄生在牛的紅細(xì)胞及淋巴細(xì)胞內(nèi)的一種蜱傳性原蟲病。臨床表現(xiàn)為高燒，異常消瘦，貧血和體表淋巴結(jié)腫大等，嚴(yán)重情況下可將牛致死，對(duì)牛機(jī)體危害極大[1]。該病分布廣泛，有明顯的地域性，在俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)、韓國(guó)、日本、澳大利亞等國(guó)家及地區(qū)均有報(bào)道[2]，我國(guó)從1964年初次在貴州省被報(bào)導(dǎo)乳牛血液中發(fā)現(xiàn)牛東方泰勒蟲以來，我國(guó)各個(gè)地區(qū)也接踵報(bào)道了該病。1980年，關(guān)明浩等[3]首次報(bào)道吉林省存在牛東方泰勒蟲病，這種疾病的發(fā)現(xiàn)是從外地向集安縣引進(jìn)的22 頭牛中，發(fā)現(xiàn)22 頭牛的染病率為100%，死亡率高達(dá)13.6%。隨著我省養(yǎng)牛業(yè)的普遍發(fā)展和流行，至今，吉林省各地區(qū)已有10個(gè)縣市均有牛東方泰勒蟲病的普遍流行[4]。

牛東方泰勒蟲裂殖子主要表面蛋白(MPSP)基因是泰勒蟲屬的一種保守性蛋白，在溫和性泰勒蟲屬中，該基因已成為流行病學(xué)調(diào)查和研究的標(biāo)志性蛋白[5]。1995年，Kubota S 等根據(jù)MPSP 基因（p33/p32）設(shè)計(jì)了2 對(duì)引物，可擴(kuò)增I 型和C 型p33/p32 基因，結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切分析，發(fā)現(xiàn)所研究的大多數(shù)牛東方泰勒蟲感染的犢牛都至少含有兩種不同型的混合感染。1996年，Kubota S 等根據(jù)水牛泰勒蟲基因，設(shè)計(jì)了另外一對(duì)引物，結(jié)合I 型和C 型p33/p32 基因?qū)?yīng)的2 對(duì)引物，PCR 和擴(kuò)增產(chǎn)物酶切分析日本和澳大利亞的瑟氏/水牛泰勒蟲，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)不同的等位型（C 型、I 型、B1 型和B2型）。本試驗(yàn)以牛東方泰勒蟲裂殖子主要表面蛋白基因(MPSP)為靶標(biāo)，使用等位特異的PCR 方法，運(yùn)用三對(duì)不同的等位特異型引物(Chitose C-、Ikeda I-和buffeli B-型)做PCR 檢測(cè)，對(duì)吉林省龍井地區(qū)的牛東方泰勒蟲的多態(tài)性進(jìn)行分析，采用血涂片染色鏡檢法并結(jié)合PCR 方法，對(duì)牛東方泰勒蟲病進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 引物的合成

依據(jù)Yu[5]文獻(xiàn)合成東方泰勒蟲擴(kuò)增引物及基因分型引物，通用引物為Ts-U 和Ts-R；I-型分型引物為TS-R 和TS-I；C-型分型引物為TS-R 和TS-C；B-型分型引物為TS-R 和TS-B。

1.2 血液樣本的采集

樣品采自吉林省龍井市某牛場(chǎng)，頸靜脈無菌采集抗凝血，現(xiàn)場(chǎng)制備血液涂片，共采集53 份。

1.3 血涂片鏡檢

血液涂片，甲醇固定2 min，自然干燥，50 倍稀釋的姬姆薩原液（默克公司）浸染12 h，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行蟲體檢查。

1.4 DNA 的提取

按全血DNA 提取試劑盒（Takara 公司）操作說明書步驟分別提取53 份龍井牛的血液樣本中牛東方泰勒蟲基因組DNA。

1.5 PCR 擴(kuò)增與分型鑒定

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延 伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 mi n。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 進(jìn)行方差分析血涂片鏡檢結(jié)果和PCR 結(jié)果的結(jié)果分析。

2 結(jié) 果

2.1 血涂片染色鏡檢結(jié)果

53 份涂片經(jīng)姬姆薩氏染色后，可在光學(xué)顯微鏡下觀察到牛紅細(xì)胞內(nèi)的東方泰勒蟲體，紅細(xì)胞染色質(zhì)呈淡紅色，蟲體包漿呈藍(lán)紫色，如圖1 所示。所采集的樣本中有15 份呈血液涂片鏡檢陽性，陽性率為28.30%（15/53）。

圖1 血液涂片姬姆薩染色鏡檢結(jié)果（×1000）

2.2 PCR 檢測(cè)結(jié)果

53 份龍井地區(qū)的血液樣本用引物Ts-U 和Ts-R進(jìn)行PCR 檢測(cè)，其中17 份被檢測(cè)呈陽性，陽性率為32.08%（17/53）。部分血液樣本東方泰勒蟲PCR 檢測(cè)結(jié)果，如圖2 所示。

圖2 部分血液樣本東方泰勒蟲PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.3 東方泰勒蟲基因型分析

對(duì)已挑選的陽性樣品，分別使用三對(duì)不同的等位特異型引物(Chitose C-型、Ikeda I-型和buffeli B-型)做PCR 檢測(cè)，結(jié)果表明：17個(gè)陽性樣品基因型屬C-型和I-型，C-型的陽性率和I-型的陽性率均為13.21%（7/53），而B-型僅為7.55%（4/53），且有兩種基因型的混合感染，B 型和I 型混合感染率為1.87%（1/53），B 型和C 型混合感染率1.87%（1/53），并且還存在兩個(gè)陽性未測(cè)出類型。圖3A 為部分陽性血液樣本東方泰勒蟲PCR C-型檢測(cè)結(jié)果，圖3B 為部分陽性血液樣本東方泰勒蟲PCR I-型檢測(cè)結(jié)果，圖3C 為部分陽性血液樣本東方泰勒蟲PCR B-型檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示，在吉林省延邊朝鮮族自治州龍井市牛東方泰勒蟲存在至少三種亞型，即T.orientalis C 型、T.orientalis B 型和 T.orientalis I 型。

圖3 部分陽性血液樣本東方泰勒蟲分型PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.4 PCR 檢測(cè)結(jié)果與血涂片結(jié)果對(duì)比分析

53 份液樣本經(jīng)PCR 檢測(cè)，其中17 份陽性，陽性率為32.08%（17/53），而鏡檢結(jié)果陽性為15 份，陽性率為28.30%（15/53）。部分血液樣本東方泰勒蟲PCR 檢測(cè)結(jié)果明顯高于鏡檢的陽性率，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出，差異極顯著（p＜0.01）。53 份血液樣本中，PCR 方法檢測(cè)的陽性率為32.08%(17/53) 明顯高于姬姆薩染色法檢測(cè)的陽性率28.30%(15/53)，其中有2 份在鏡檢中觀察認(rèn)為陰性的2 份血液樣本經(jīng)PCR 檢測(cè)后也為陽性，說明PCR 方法比姬姆薩染色鏡檢法更為敏感。

3 討論

牛東方泰勒蟲病是一種慢性、消耗性的寄生蟲病。牛感染東方泰勒蟲后經(jīng)過一段的急性期，常進(jìn)入慢性無臨床癥狀時(shí)期，成為牛東方泰勒蟲的攜帶者，牛在整個(gè)生命周期中可能會(huì)持續(xù)感染該蟲體、雖然，牛東方泰勒蟲病很少引起牛的死亡，但是，該蟲體長(zhǎng)期隱匿于牛體內(nèi)，嚴(yán)重影響到牛的生長(zhǎng)發(fā)育和牛類產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，給養(yǎng)牛業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。牛東方泰勒蟲通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，存在十幾種基因型，目前只有C-型、B-型、I-型、Thai-型可以通過PCR 方法進(jìn)行區(qū)分，其他基因型需要通過基因測(cè)序知道其分型，本試驗(yàn)中未能通過PCR 檢測(cè)出的類型可能屬于C-型、B-型、I-型之外的一種基因型。

結(jié)果顯示，龍井市是牛東方泰勒蟲病的流行地區(qū)，存在至少三種MPSP 基因型，導(dǎo)致這種情況的原因可能是多數(shù)的長(zhǎng)角血蜱都生活在山區(qū)的灌木叢中，由于龍井市的地區(qū)處于山區(qū)，非常適合長(zhǎng)角血蜱的生長(zhǎng)和繁育，所以龍井牛接觸長(zhǎng)角血蜱的概率相對(duì)其他地區(qū)會(huì)比較大，從而非常容易感染牛東方泰勒蟲病。其次，可能由于畜舍環(huán)境衛(wèi)生、消毒措施不到位，沒有專業(yè)防護(hù)手段，導(dǎo)致蜱進(jìn)入畜舍內(nèi)叮咬了牛從而感染。牛東方泰勒蟲病在該地區(qū)處于流行趨勢(shì)，且呈明顯上升趨勢(shì)，該病已經(jīng)對(duì)其地區(qū)及周邊地區(qū)的養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅[7]，有關(guān)部門應(yīng)當(dāng)采取相應(yīng)的措施進(jìn)行有效的防治和預(yù)防該病的持續(xù)流行。