李華雨，王茹楠，王小飛

河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司技術(shù)中心，河南省許昌市金葉大道666 號 461000

制漿是造紙法再造煙葉生產(chǎn)的關(guān)鍵工藝之一，其漿料特性直接影響后續(xù)的生產(chǎn)過程和產(chǎn)品品質(zhì)。漿料處理過程中，溫度一般維持在40 ℃左右，系統(tǒng)中豐富的無機鹽、多糖等［1-2］為微生物的生長提供了適宜的生長環(huán)境，導(dǎo)致漿料發(fā)酸、變質(zhì)，嚴重影響產(chǎn)品的感官質(zhì)量，并對生產(chǎn)線造成污染，影響生產(chǎn)效能。

目前，造紙行業(yè)漿料新鮮度的相關(guān)研究主要集中在漿料防腐［3-7］及微生物種類的鑒別方面［8-13］，薛長森等［9］對再造煙葉上網(wǎng)漿料中主要微生物群進行分離研究，發(fā)現(xiàn)引起漿料腐敗變質(zhì)的主要菌群為約氏不動桿菌和惡臭假單胞菌，但并沒有明確微生物菌落數(shù)量與漿料變質(zhì)程度的關(guān)系。吳芳芳等［10］對制漿造紙過程循環(huán)白水中的細菌多樣性進行了研究，表明造紙白水具有較豐富的細菌多樣性，以變形菌為優(yōu)勢菌群。再造煙葉生產(chǎn)過程中，漿料在密閉的管道中輸送，厭氧細菌發(fā)酵為糖酶，釋放出揮發(fā)性脂肪酸等代謝副產(chǎn)物［5-6,14］，揮發(fā)性脂肪酸包括甲酸、乙酸、丁酸、丙酮酸和戊酸等。

因此，采用離子色譜法［15-17］研究了漿料振蕩時間與其中有機酸質(zhì)量分數(shù)的關(guān)系，找出有機酸質(zhì)量分數(shù)的變化規(guī)律，旨在為再造煙葉生產(chǎn)過程中漿料的駐留時間和工藝優(yōu)化提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

煙梗煙末（河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司TS 品牌配方）；針葉纖維（喬治王子，加拿大）；闊葉纖維（鸚鵡，巴西）。

甲酸鈉、戊酸鈉（優(yōu)級純，天津市歐博凱化工產(chǎn)品銷售有限公司）；乳酸鈉、乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉、丙酮酸鈉、己酸鈉（標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所）；檸檬酸鈉、苯甲酸、酒石酸鈉、草酸鈉（標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr.Ehrenstorfer 公司）。實驗用水為超純水，電阻率大于18.2 MΩ·cm（25 ℃）。

ICS-6000 高壓離子色譜儀（配置全自動在線電解淋洗液發(fā)生器、溫控電導(dǎo)檢測器）、ADRS600自動電解連續(xù)再生微膜抑制器（4 mm）、變色龍Chromeleon7.2 色譜工作站（美國賽默飛世爾公司）；0.22 μm 針頭過濾器（天津富集色譜技術(shù)發(fā)展公司）；MD-3000 盤磨精漿機（巴西Regmed 公司）；SS 三足離心機（張家港永泰離心機制造有限公司）；DC-TQ 型實驗室多功能提取罐（50 L，上海達程設(shè)備有限公司）；ZHP-2102L 恒溫振蕩培養(yǎng)箱（常州普天儀器制造有限公司）；Milli-Q 型超純水儀（美國默克密理博公司）；RFS 微生物產(chǎn)氣測量儀（美國Ankom 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

取上述各試劑分別配制1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，放置于高密度聚乙烯瓶中，于4 ℃冰箱中保存，使用時稀釋至所需濃度。

1.2.2 漿料的制備

煙梗煙末漿料（TS）：選取500 g 煙梗原料，采用多功能提取罐于60 ℃熱水提取30 min，采用盤磨精漿機磨漿，將煙梗漿料以3 000 r/min 離心5 min；然后與500 g 配方煙末混合，60 ℃熱水提取20 min，采用盤磨精漿機將梗和煙末混合磨漿；將梗末漿料以3 000 r/min 離心5 min。用60 ℃熱水提取離心后的漿料10 min，以3 000 r/min 離心5 min；重復(fù)提取9 次。漿料含水率為79.19%，冷凍保存。

針葉纖維與闊葉纖維漿料（ZK）：針葉、闊葉纖維漿板，以針葉：闊葉=6：4（質(zhì)量比）的比例共500 g，采用盤磨精漿機磨漿，將漿料以3 000 r/min離心5 min，然后用60 ℃熱水提取10 min，再以3 000 r/min 離心5 min，重復(fù)提取3 次。漿料含水率為61.61%，冷凍保存。

1.2.3 不同振蕩時間漿料樣品的制備

新鮮漿料：稱取冷凍保存的煙梗煙末漿料和針葉闊葉漿料各3.73 g，分別放入250 mL 磨口錐形瓶中，加入25 mL 自來水，搖勻后立即加入250 μL氫氧化鈉水溶液（40 mol/L），以12 000 r/min 離心10 min，上清液過0.22 μm針頭過濾器，冷凍待分析。

不同放置時間漿料樣品的制備：稱取3.73 g 冷凍保存的煙梗煙末漿料，放入250 mL 磨口錐形瓶中，加入25 mL 自來水，搖勻，共18 個瓶子，一式2份。一份用磨口瓶塞塞緊，一份用保鮮膜扎緊瓶口，然后在保鮮膜上用利器扎4 個孔，均放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，溫度保持50 ℃，振蕩速率120 r/min。每隔1 h 取樣，立即加入250 μL 氫氧化鈉水溶液（40 mol/L）搖勻，以12 000 r/min 離心10 min，上清液過0.22 μm 針頭過濾器，濾液冷凍待分析。不同振蕩時間的針葉闊葉漿料樣品的制備同煙梗煙末漿料的制備方法。高壓離子色譜測試條件：

色譜柱：IonPac AG11-HC 濃縮柱（4 mm×50 mm）、IonPac AS11-HC 離子交換柱（4 mm×250 mm）、固相萃取柱（IonPac NG1、InGuard Na）；流動相：KOH 溶液，由淋洗液自動發(fā)生裝置產(chǎn)生；梯度洗脫條件：0～15 min，KOH 濃度為 0.8 mmol/L；15～30 min，KOH 濃 度 由 0.8 mmol/L 升 至 12.0 mmol/L；30 ～ 45 min，KOH 濃度由 12.0 mmol/L 升至 38.0 mmol/L；45 ～ 50 min，KOH 濃度由 38.0 mmol/L 升至 50.0 mmol/L，保持5 min；50 ～ 55 min，KOH 濃度降至 0.8 mmol/L；流速：1.00 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測池溫度：35 ℃；抑制器電流：124 mA；進樣體積：20 μL。

1.2.4 微生物產(chǎn)氣

稱取冷凍保存的煙梗煙末漿料33.26 g，一式3份，分別放入RFS 微生物產(chǎn)氣測量儀的3 個250 mL 樣品孵化瓶中，分別加入220 mL 自來水，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，保持溫度50 ℃，以120 r/min的速率振蕩20 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性有機酸的分析

漿料制備過程中提取次數(shù)較多，煙草中的蘋果酸、異戊酸、苯乙酸等殘留較少，且實驗中主要是考察漿料在振蕩過程中細菌發(fā)酵釋放出揮發(fā)性脂肪酸質(zhì)量分數(shù)的變化，檸檬酸是發(fā)酵有機酸之一，因此考察漿料在振蕩過程中乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、戊酸、己酸、酒石酸、草酸、苯甲酸和檸檬酸質(zhì)量分數(shù)的變化。利用離子色譜閥切換和固相萃取原理，注入定量環(huán)（閥1）的樣品被純水帶入IonPac NG1 和InGuard H 固相萃取柱，樣品基質(zhì)和重金屬離子分別被截留在固相萃取柱NG1 和H 柱上，有機酸離子不被截留而進入后續(xù)濃縮柱AG11-HC（閥2）色譜系統(tǒng)進行分離，最后流進電導(dǎo)檢測器；以有機相溶劑將截留在固相萃取柱上的樣品基質(zhì)清洗至廢液中，實現(xiàn)固相萃取柱的清洗再生。具體分析流程見圖1。

圖1 樣品中有機酸分離流程Fig.1 Separation process of organic acids in samples

取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用自動進樣器，從低濃度至高濃度依次將其引入定量環(huán)，由淋洗液經(jīng)六通閥載入陰離子交換柱，分離并檢測各有機酸根離子。圖2 為標(biāo)樣中各有機酸根均為1 mg/L 時以及漿料樣品的分離色譜圖，可知：各有機酸根可較好地達到基線分離；樣品直接過濾后進樣，有機酸也能得到有效分離。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和漿料樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of standard solutions and pulp samples

優(yōu)化的色譜條件下，以各有機酸根離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各有機酸根離子的線性回歸方程見表1，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，說明線性關(guān)系良好。草酸根與苯甲酸根在優(yōu)化條件下于同一時間被淋洗（圖2），用草酸根與苯甲酸根質(zhì)量分數(shù)之和作線性方程定量草酸根與苯甲酸根的重合峰。取已知有機酸根質(zhì)量分數(shù)的樣品溶液進行加標(biāo)回收實驗，同一添加水平平行測定6 次，計算回收率。各有機酸根離子的回收率均大于95%，回收率的RSD均小于5%，說明此方法可靠性較好。

2.2 漿料封閉振蕩狀態(tài)下有機酸質(zhì)量分數(shù)的變化

再造煙葉生產(chǎn)經(jīng)過多級提取、制漿等工序，同時生產(chǎn)用水的一部分是循環(huán)水，很難保證漿料新鮮。為了真實反映新鮮漿料振蕩時間與有機酸質(zhì)量分數(shù)的關(guān)系，采用實驗室磨漿、多次提取的方式制備新鮮漿料（1.2 節(jié)）。

將煙梗煙末配方漿料和外加纖維漿料分別封閉振蕩1 ～9 h，樣品中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸、丙酮酸、酒石酸、苯甲酸+草酸（苯甲酸/草酸）、檸檬酸等有機酸根的測定結(jié)果如表2所示。

由表2 可知，由煙梗煙末制成的漿料經(jīng)封閉振蕩，漿料中有機酸質(zhì)量分數(shù)隨振蕩時間而變化。其中，由于丙酸的量非常低，可忽略其隨振蕩時間的變化；乳酸、丁酸及戊酸的量也較低，隨振蕩時間變化無規(guī)律；丙酮酸和己酸的量稍高，隨振蕩時間呈無規(guī)律變化狀態(tài)，振蕩6 h 時質(zhì)量分數(shù)均較高；苯甲酸/草酸、檸檬酸、酒石酸及甲酸在樣品中的量較高，均隨振蕩時間延長變化無規(guī)律，酒石酸及甲酸在振蕩6 h時質(zhì)量分數(shù)最高；漿料中乙酸的量呈逐漸升高又降低的趨勢，6 h時樣品中質(zhì)量分數(shù)最高。

表1 各有機酸根離子的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回收率和精密度Tab.1 Linear equations, correlation coefficients, recoveries and precisions of organic acid ions

表2 漿料封閉振蕩不同時間樣品中有機酸的質(zhì)量分數(shù)Tab.2 Contents of organic acids in samples oscillated for different durations in closed state （mg·L－1）

外加纖維制成的漿料于50 ℃封閉振蕩，乳酸、丙酸、丁酸、戊酸、丙酮酸及己酸的質(zhì)量分數(shù)低且隨時間延長變化無規(guī)律，丁酸、乳酸分別在振蕩4、5 h 時質(zhì)量分數(shù)最高，丙酮酸和己酸在振蕩6 h時質(zhì)量分數(shù)最高；檸檬酸、酒石酸和苯甲酸/草酸的量較高，檸檬酸質(zhì)量分數(shù)隨振蕩時間基本無變化，酒石酸呈下降趨勢，苯甲酸/草酸呈升高趨勢（3 h 和7 h 的樣品除外）；甲酸的質(zhì)量分數(shù)較高，隨振蕩時間呈逐漸升高又平穩(wěn)下降趨勢，6 h 及7 h樣品中甲酸質(zhì)量分數(shù)均較高；乙酸的質(zhì)量分數(shù)在振蕩2 h 后呈逐漸升高又下降趨勢，6 h 時樣品中乙酸的質(zhì)量分數(shù)最高。

煙梗煙末制成的漿料50 ℃封閉振蕩1～9 h，有機酸總質(zhì)量分數(shù)呈無規(guī)律變化（圖3），6 h 時質(zhì)量分數(shù)最高；外加纖維制成的漿料，其有機酸總量總體呈緩慢升高又下降趨勢，6 h 時有機酸總量達最高值（圖3）。

圖3 封閉狀態(tài)下不同振蕩時間漿料樣品中有機酸總量的變化Fig.3 Changes of total content of organic acids in samples oscillated for different durations in closed state

2.3 漿料敞口振蕩狀態(tài)下有機酸質(zhì)量分數(shù)的變化

煙梗煙末漿料敞口振蕩1～9 h 樣品中各有機酸根測定結(jié)果見表3?？芍?，在測定的煙梗煙末漿料樣品中，乙酸質(zhì)量分數(shù)稍高，隨振蕩時間延長逐漸升高然后緩慢降低，5、6 及7 h 時質(zhì)量分數(shù)均較高；檸檬酸、酒石酸、甲酸及苯甲酸/草酸質(zhì)量分數(shù)較高，檸檬酸及酒石酸在振蕩2 h 后質(zhì)量分數(shù)基本無變化，甲酸及苯甲酸/草酸均隨振蕩時間變化無規(guī)律，苯甲酸/草酸在振蕩5 h 時質(zhì)量分數(shù)最高；己酸及丙酮酸的質(zhì)量分數(shù)稍高，隨振蕩時間變化無規(guī)律；乳酸、丁酸及戊酸的質(zhì)量分數(shù)低且隨振蕩時間變化無規(guī)律；丙酸的量非常低可忽略其變化。

外加纖維漿料樣品中的甲酸及乙酸質(zhì)量分數(shù)較高，甲酸的量隨振蕩時間變化無規(guī)律，乙酸總體呈逐漸升高又降低趨勢，5 h 時均達到最高值；乳酸、丁酸、丙酮酸、戊酸及己酸的質(zhì)量分數(shù)較低，隨振蕩時間變化無規(guī)律，丙酮酸在振蕩5 h 時量最高；檸檬酸、酒石酸及苯甲酸/草酸的質(zhì)量分數(shù)較高，酒石酸質(zhì)量分數(shù)總體呈逐漸降低趨勢，苯甲酸/草酸及檸檬酸質(zhì)量分數(shù)總體呈逐漸升高趨勢。

煙梗煙末漿料和外加纖維漿料50 ℃敞口振蕩1～9 h，有機酸總量在7 h 內(nèi)逐漸升高又下降，5 h 時達最大值（圖4）。

圖4 敞口狀態(tài)下不同振蕩時間漿料樣品中有機酸總量的變化Fig.4 Contents of total organic acids in samples oscillated for different durations in open state

表3 漿料樣品敞口振蕩不同時間有機酸的質(zhì)量分數(shù)Tab.3 Contents of organic acids in pulp samples oscillated for different durations in open state （mg·L-1）

2.4 相同振蕩條件不同漿料中有機酸質(zhì)量分數(shù)變化趨勢的相關(guān)性分析

將煙梗煙末制成的漿料與外加纖維制成的漿料在50 ℃密閉振蕩過程中有機酸質(zhì)量分數(shù)的變化進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。不同振蕩時間的煙梗煙末漿料中己酸、丙酮酸、草酸/苯甲酸及酒石酸的變化趨勢分別與外加纖維漿中己酸、丙酮酸、草酸/苯甲酸及酒石酸的變化趨勢相關(guān)性不顯著，煙梗煙末漿料中乙酸的變化趨勢與外加纖維漿中乙酸的變化趨勢顯著相關(guān)（P＜0.05），煙梗煙末漿料中甲酸及檸檬酸質(zhì)量分數(shù)在振蕩過程中的變化趨勢分別與外加纖維漿料中的變化趨勢極顯著相關(guān)（P＜0.01）。煙梗煙末漿料中有機酸總量的變化趨勢與外加纖維漿中的相關(guān)性不顯著。

50 ℃敞口振蕩，煙梗煙末漿料與外加纖維漿料不同時間有機酸質(zhì)量分數(shù)變化的相關(guān)性分析結(jié)果見表5。不同振蕩時間的煙梗煙末漿料中乙酸、苯甲酸/草酸質(zhì)量分數(shù)的變化趨勢分別與外加纖維漿料中的變化趨勢顯著相關(guān)（P＜0.05），煙梗煙末漿料中甲酸、己酸及酒石酸質(zhì)量分數(shù)在振蕩過程中的變化趨勢分別與外加纖維漿料中的變化趨勢極顯著相關(guān)（P＜0.01），丙酮酸和檸檬酸的質(zhì)量分數(shù)在振蕩過程中的變化趨勢相關(guān)性不顯著。煙梗煙末漿料中有機酸總量的變化趨勢與外加纖維漿中的變化趨勢極顯著相關(guān)（P＜0.01），煙梗煙末漿料在振蕩過程中有機酸總量的變化分別與其甲酸、己酸、丙酮酸和苯甲酸/草酸質(zhì)量分數(shù)的變化趨勢極顯著相關(guān)（P＜0.01）。

2.5 漿料封閉振蕩時間與產(chǎn)氣壓力的關(guān)系

采用微生物產(chǎn)氣測量儀測量漿料封閉振蕩狀態(tài)下樣品孵化瓶內(nèi)的產(chǎn)氣量，樣品孵化瓶內(nèi)產(chǎn)氣量的變化表示微生物自然發(fā)酵產(chǎn)生氣體的多少，可側(cè)面反映樣品中微生物新陳代謝的速率。以樣品振蕩時間為橫坐標(biāo)，3 個樣品孵化瓶內(nèi)產(chǎn)氣量的平均值為縱坐標(biāo)繪圖（圖5）?？芍?，封閉振蕩5 ～7 h時微生物自然發(fā)酵產(chǎn)生氣體量較大，與漿料中有機酸質(zhì)量分數(shù)的變化規(guī)律一致。

表4 煙梗煙末漿料與外加纖維漿料在封閉振蕩過程中有機酸質(zhì)量分數(shù)變化的相關(guān)性分析①Tab.4 Correlation analysis between organic acid contents in tobacco pulp and fiber pulp oscillated for different durations in closed state

表5 煙梗煙末漿料與外加纖維漿料在敞口振蕩過程中有機酸質(zhì)量分數(shù)變化的相關(guān)性分析Tab.5 Correlation analysis on organic acid contents between tobacco pulp and fiber pulp oscillated for different durations in open state

圖5 煙梗煙末漿料封閉振蕩不同時間的產(chǎn)氣量Fig.5 Gas production in tobacco pulp samples oscillated for different durations in closed state

3 討論

煙梗煙末漿料及針葉闊葉漿料在封閉和敞口狀態(tài)下振蕩，甲酸質(zhì)量分數(shù)變化無規(guī)律，封閉狀態(tài)下煙梗煙末及針葉闊葉漿料中的乙酸緩慢升高后逐漸降低，敞口狀態(tài)下針葉闊葉漿料中的乙酸質(zhì)量分數(shù)逐漸升高后降低，煙梗煙末漿料中的乙酸隨振蕩時間緩慢升高為一恒值。封閉振蕩煙梗煙末漿料中乙酸、甲酸質(zhì)量分數(shù)的變化趨勢分別與外加纖維漿料中極顯著相關(guān)（P＜0.01）；敞口振蕩煙梗煙末漿料中乙酸變化趨勢與纖維漿料中顯著相關(guān)（P＜0.05）、甲酸變化趨勢極顯著相關(guān)（P＜0.01）。再造煙葉生產(chǎn)過程中，漿料在密閉管道中的處理與輸送時間一般不超過5 h，隨著季節(jié)和車間溫度的變化，有機酸質(zhì)量分數(shù)的變化會稍有不同，可選擇乙酸作為漿料的特征成分進行監(jiān)控。

4 結(jié)論

（1）煙梗煙末漿料及針葉闊葉漿料分別于50 ℃封閉及敞口振蕩1 ～9 h，漿料中各有機酸的量隨振蕩時間變化規(guī)律不同。煙梗煙末及針葉闊葉漿料中的乙酸隨封閉振蕩時間延長緩慢升高后逐漸降低，敞口振蕩隨時間緩慢升高為一恒值。針葉闊葉漿料中甲酸、乙酸及有機酸總量分別在封閉振蕩6 h 和敞口振蕩5 h 時質(zhì)量分數(shù)最高。

（2）漿料封閉振蕩5 ～7 h 時微生物自然發(fā)酵產(chǎn)氣量達最大值，與漿料中有機酸量的變化一致。

（3）50 ℃封閉振蕩煙梗煙末漿料中乙酸、甲酸質(zhì)量分數(shù)的變化趨勢分別與外加纖維漿料中極顯著相關(guān)（P＜0.01）；敞口振蕩煙梗煙末漿料中乙酸變化趨勢與纖維漿料中顯著相關(guān)（P＜0.05），甲酸變化趨勢與纖維漿料中極顯著相關(guān)（P＜0.01）?？蛇x擇乙酸作為漿料的特征成分進行監(jiān)控。