宋明輝 施春雷 李瓊瓊 史賢明 楊美成*

（1 上海市食品藥品檢驗所 國家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢測技術(shù)重點實驗室 上海201203 2 上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院 上海200240）

金黃色葡萄球菌是一種重要的食源性致病菌，由其引起的食物中毒是一個世界性衛(wèi)生問題，對公共健康和食品安全帶來巨大威脅[1]。2011年，我國衛(wèi)生部根據(jù)致病菌風險評估結(jié)果，參照國際食品微生物標準委員會采樣方案和限量規(guī)定，對食品安全國家標準 《速凍面米制品》（GB 19295-2011）進行了修訂，其中金黃色葡萄球菌由不得檢出調(diào)整為限量檢出[2]。2013年實施的致病菌限量通用標準GB 29921-2013 也將預包裝食品（不適用罐頭類食品） 中的金黃色葡萄球菌檢測修訂為限量檢出[3]。雖然國家對食品安全標準進行了調(diào)整，但配套的金黃色葡萄球菌定量檢測方法仍為傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法。該方法不僅耗時久（至少4～5 d），而且操作繁瑣，不能滿足當前對食品快速風險評估的要求。

熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，在檢測時間、靈敏度、成本以及高通量方面都具有很大優(yōu)勢，可實現(xiàn)對致病菌快速定性、定量檢測[4-5]。然而，直接應用qPCR 技術(shù)檢測食品中污染的致病菌時，無法區(qū)分活菌與死菌。研究表明：在細菌脅迫條件下保藏的食品會造成致病菌失活[6]，如速凍食品，因此采用qPCR 技術(shù)檢測時，無法準確定量食品中污染的致病菌。疊氮溴化丙錠（Propidium monoazide，PMA） 是一種具有高親和力的光敏反應DNA 結(jié)合染料，它可與qPCR 聯(lián)合使用，選擇性擴增活細胞中的DNA，提高檢測的準確性[7-9]。此外，對于PCR 檢測技術(shù)，檢測靶點的特異性對于致病菌準確檢測格外重要。由于靶序列變異、基因水平轉(zhuǎn)移等因素，往往會導致假陰性、假陽性等誤檢結(jié)果[10]。檢測靶點的特異性和數(shù)量限制了基于核酸檢測致病菌的能力，因此不斷發(fā)掘新的特異檢測靶點勢在必行。

金黃色葡萄球菌腸毒素A 被認為是引起食物中毒的最主要致病因子，90%以上的食物中毒菌株都攜帶腸毒素sea 基因[11-12]。與大部分腸毒素不同，腸毒素A 不受群體感應系統(tǒng)調(diào)控，在細菌數(shù)目較低時也能產(chǎn)生腸毒素，而且94 ng 的腸毒素A就能導致食物中毒[13-14]。在允許食品中較低數(shù)目金黃色葡萄球菌存在的同時，有必要對食品中腸毒素sea 基因進行檢測，來評估食品中污染腸毒素A的風險。此外，食品基質(zhì)、DNA 提取過程中殘留的有機酸及其它多種因素均可抑制PCR 反應，造成假陰性結(jié)果。在檢測體系中添加擴增內(nèi)標可有效指示檢測過程中出現(xiàn)的假陰性結(jié)果，目前被認為是分子檢測技術(shù)所必須具有的[15]。多重qPCR 技術(shù)能在一個反應中同時檢測多種致病菌或者多個致病因子，具有更高效快速的優(yōu)勢[16]。本研究擬開發(fā)一種能同時定量金黃色葡萄球菌活菌，篩查腸毒素sea 基因及指示PCR 反應假陰性的多重PMAqPCR 體系，來準確評估速凍食品中污染金黃色葡萄球菌的風險。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

胰酪大豆胨培養(yǎng)基，美國BD 公司；Baird-Parker 瓊脂基礎，美國Life Technologies 公司；PMA 染料、PMA-lite LED 光分解儀，美國Biotium公司；Qubit 3.0 熒光定量儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；Qiagen DNA 提取試劑盒，德國Qiagen 公司；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR），大連TaKaRa 公司；Mastercycler ep realplex 實時熒光定量PCR儀，德國Eppendorf 公司；LABGARD 型生物安全柜，美國Nuaire 公司。

1.2 試驗菌株

本研究使用的菌株信息見表1，其中ATCC 表示美國標準菌種收藏所，CMCC 表示中國醫(yī)學細菌菌種保藏管理中心，IQCC 表示檢驗檢疫菌種保藏中心。

表1 菌株信息表Table 1 Information of the strain

1.3 引物和探針設計

基于食源性致病菌特異性靶點發(fā)掘平臺SMM-system[17]，通過比較基因組學，獲得金黃色葡萄球菌特異靶基因RpiR （編碼表達Sucrose-specific PTS transporter protein RpiR family transcriptional regulator）。利用軟件Beacon designer 7.0，針對RpiR 和sea 基因保守區(qū)域，設計多對引物和探針，篩選出性能較好的引物和探針，見表2，其中引物由上海生工有限公司合成，探針由賽默飛世爾科技公司合成。

1.4 擴增內(nèi)標模板及探針序列

利用DNA Random Shuffling 方法[18]改組腸毒素A 基因探針序列，構(gòu)建擴增內(nèi)標探針5’-NEDATTGGTGCTGAATAGTGTGT-MGB-3’。用內(nèi)標探針序列替代腸毒素A 基因PCR 產(chǎn)物中的目標探針序列，作為擴增內(nèi)標模板序列，如下：GTGGTACACCAAACAAAACAGCTTGTAATTGGTGCTGAATAGTGTGTCATGATAATAATCGATTGA CCGAAGAGA，擴增內(nèi)標模板序列由上海生工有限公司合成。

表2 檢測引物和探針序列信息Table 2 The sequence of primers and probes used in this study

1.5 三重qPCR 檢測體系構(gòu)建與優(yōu)化

構(gòu)建包含金黃色葡萄球菌特異靶基因RpiR、腸毒素基因sea 和擴增內(nèi)標的三重qPCR 檢測體系，對引物、探針及內(nèi)標模板濃度優(yōu)化，確定最佳反應體系，如下：Premix Ex Taq （2×）12.5 μL，RpiR-F（10 μmol/L）0.5 μL，RpiR-R（10 μmol/L）0.5 μL，sea-F（10 μmol/L）0.5 μL，sea-R（10 μmol/L）0.5 μL，Probe-1（FAM，10 μmol/L）0.5 μL，Probe-2（VIC，10 μmol/L）0.5 μL，擴增內(nèi)標探針（NED，10 μmol/L）0.5 μL，擴增內(nèi)標模板（550 拷貝）1 μL，模板5 μL，無菌水3 μL。PCR 循環(huán)參數(shù)：95 ℃預變性30 s，40 個循環(huán)，每個循環(huán)的程序包括95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，采集熒光信號。

1.6 三重qPCR 檢測體系特異性及靈敏度評價

表1列出的30 株金黃色葡萄球菌以及非金黃色葡萄球菌活化后，采用Qiagen DNA 提取試劑盒進行DNA 提取，利用優(yōu)化好的三重qPCR 檢測體系，驗證靶基因RpiR 和sea 引物及探針的特異性。利用Qubit 3.0 核酸定量儀，對金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC13565（sea+）基因組DNA 濃度進行定量，質(zhì)量濃度為11.5 ng/μL，10 倍梯度稀釋后，用優(yōu)化的三重qPCR 體系分別進行擴增，以確定靶基因RpiR 和sea 的最低檢測濃度。

1.7 速凍面米制品樣品PMA 前處理

PMA 處理速凍面米制品樣品的具體步驟如下：稱取食品樣品25 g，加入225 mL 無菌生理鹽水，均質(zhì)拍打100 s，吸取均質(zhì)液10 mL，10 000 r/min 離心1 min，棄上清；加入含10%TritonX100 的TE 緩沖液10 mL，振蕩混勻，10 000 r/min 離心1 min，棄上清；加入含10%TritonX100 的TE 緩沖液5 mL，振蕩混勻后，加入PMA 溶液，使其終質(zhì)量濃度為30 μg/mL[19]?；靹蚝螅凳曳跤? min，然后置于PMA-lite LED 光分解儀器上作用30 min 后，用于后續(xù)DNA 提取及qPCR 檢測。

1.8 三重PMA-qPCR 定量標準曲線的繪制

金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物定量標準曲線繪制：將過夜培養(yǎng)的標準菌株ATCC13565 新鮮菌液平板計數(shù)后進行10 倍梯度稀釋，濃度分別為1.02×107，1.02×106，1.02×105，1.02×104，1.02×103，1.02×102，1.02×101CFU/mL，每個濃度梯度3 個平行，加入PMA 溶液使其終質(zhì)量濃度為30 μg/mL，PMA-lite LED 光分解30 min。采用Qiagen 試劑盒進行DNA 提取，qPCR 定量檢測后，根據(jù)每個濃度對應的Ct 值（Ct＜35），繪制金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物的PMA-qPCR 定量標準曲線。

速凍面米制品中金黃色葡萄球菌定量標準曲線繪制：將過夜培養(yǎng)的ATCC13565 新鮮菌液，平板計數(shù)后10 倍梯度稀釋。從超市購買速凍豬肉水餃和速凍小饅頭樣品，采用國標GB 4789.10-2016 的方法進行金黃色葡萄球菌檢測[20]。在無菌條件下，分別稱取25 g 金黃色葡萄球菌陰性的速凍豬肉水餃和速凍小饅頭樣品，依次加入225 mL生理鹽水和稀釋計數(shù)后的金黃色葡萄球菌菌液，使食品樣品中金黃色葡萄球菌的污染量分別為1.9×108，1.9×107，1.9×106，1.9×105，1.9×104，1.9×103，1.9×102，1.9×101CFU/g，每個濃度梯度3 個平行。參照1.7 節(jié)的步驟進行速凍面米制品PMA 前處理，然后采用Qiagen 試劑盒進行DNA 提取。qPCR 定量檢測后，把不同種類速凍面米食品中獲取的有效Ct 值進行綜合評價分析，繪制金黃色葡萄球菌在速凍面米食品中的PMA-qPCR 定量標準曲線。

1.9 三重PMA-qPCR 檢測方法性能評估

稱取25 g 金黃色葡萄球菌檢測陰性（采用國標GB 4789.10-2016 方法預先檢測） 的速凍豬肉水餃樣品，加入225 mL 生理鹽水，均質(zhì)儀拍打100 s 后，分別加入標準菌株ATCC13565（sea+）和ATCC25923（sea-）新鮮菌液，制備10 份金黃色葡萄球菌人工污染樣品，每個樣品3 個平行。樣品中污染菌液濃度分別約為102，103，105，107CFU/g，其中1～4 號樣品為標準菌株ATCC13565 污染樣品，5～8 號樣品為標準菌株ATCC13565 污染樣品，9～10 號樣品為兩株菌的混合污染樣品（樣品9為ATCC25923：107CFU/g 和ATCC13565：103CFU/g，樣品10 為ATCC25923：107CFU/g 和ATCC13565：105CFU/g）。然后采用本研究建立的PMA-qPCR方法定量金黃色葡萄球菌，根據(jù)Ct 值，利用繪制的速凍面米食品中金黃色葡萄球菌定量標準曲線，定量金黃色葡萄球菌的濃度。人工污染樣品同時采用國標GB 4789.10-2016 方法進行金黃色葡萄球菌平板計數(shù)，以評價三重PMA-qPCR 方法的檢測性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性評價

金黃色葡萄球菌特異靶基因RpiR 的檢測引物探針的特異性評價結(jié)果，如圖1a 所示，結(jié)果表明6 株金黃色葡萄球菌均得到有效擴增（Ct＜20），而24 株非金黃色葡萄球菌均未見明顯擴增 （Ct＞35）。腸毒素A 基因的檢測引物探針的特異性評價結(jié)果，如圖1b 所示，3 株sea 陽性金黃色葡萄球菌均獲得有效擴增（Ct＜20），而在27 株sea 陰性菌株中均未見明顯擴增（Ct＞35）。特異性評價結(jié)果表明靶基因RpiR 和sea 的檢測引物和探針具有良好的特異性。

圖1 金黃色葡萄球菌特異靶基因RpiR（a）和腸毒素A 基因（b）檢測引物和探針特異性評價Fig.1 The specificity result of primers and probes for the targeted RpiR （a） and sea gene （b）

2.2 三重qPCR 檢測體系靈敏度評價結(jié)果

優(yōu)化建立的三重qPCR 反應體系的檢測靈敏度評價結(jié)果如圖2所示，標準菌株ATCC13565 基因組DNA 等比稀釋，qPCR 檢測結(jié)果呈規(guī)律性Ct值變化，說明qPCR 檢測體系和儀器參數(shù)穩(wěn)定。由結(jié)果可知，當基因組DNA 質(zhì)量濃度大于115 fg/μL（圖2標記為D），靶基因RpiR 和腸毒素A 基因的擴增Ct 值大于35，表明其不能獲得有效擴增，因此靶基因RpiR 和腸毒素A 基因的檢測下限同為115 fg/μL。由于擴增內(nèi)標和腸毒素A 基因存在競爭關(guān)系，因此，進一步研究了不同腸毒素A基因模板濃度對擴增內(nèi)標的影響，評價結(jié)果如圖3所示，當多重檢測體系中添加的內(nèi)標模板濃度為550 拷貝/反應，腸毒素A 基因模板質(zhì)量濃度＞11.5 pg/μL 時，內(nèi)標模板不能獲得有效擴增，而腸毒素A 基因可以有效檢測。

圖2 三重qPCR 反應體系中靶基因RpiR 和sea 的檢測靈敏度評價結(jié)果Fig.2 The DNA detection limit for the targeted RpiR and sea gene in triplex qPCR reaction system

圖3 三重qPCR 反應體系中擴增內(nèi)標的有效擴增能力評價Fig.3 Amplification efficiency of internal amplification control in triplex qPCR reaction system

2.3 三重PMA-qPCR 定量標準曲線

以金黃色葡萄球菌濃度的對數(shù)值為橫坐標，Ct 值為縱坐標建立標準曲線。其中金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物的定量標準曲線如圖4a 所示，靶基因RpiR 在目標菌液濃度101～107CFU/mL 范圍內(nèi)，與擴增Ct 值之間可以獲得良好線性關(guān)系 （Ct＜35），R2=0.9960；而腸毒素A 基因在目標菌液濃度102～107CFU/mL 范圍內(nèi)，與擴增Ct 值之間可以獲得良好線性關(guān)系（Ct＜35），R2=0.9998。速凍面米食品中金黃色葡萄球菌的定量標準曲線如圖4b 所示，靶基因RpiR 在目標菌液濃度103～107CFU/g 范圍內(nèi)可以得到有效擴增，線性良好，R2=0.9943，而腸毒素A 基因在目標菌液濃度103～107CFU/g 范圍內(nèi)也可以得到有效擴增，線性良好，R2=0.9973。

2.4 三重PMA-qPCR 檢測方法的性能評價

人工污染的10 份速凍面米食品樣品，采用三重PMA-qPCR 進行檢測，并在所建立的標準曲線上計算獲得金黃色葡萄球菌活菌定量結(jié)果，同時采用國標GB 4789.10-2016 中平板計數(shù)法對PMA-qPCR 檢測方法的性能進行評估。人工污染食品樣品中金黃色葡萄球菌的定量檢測結(jié)果如表3所示，當金黃色葡萄球菌污染量大于103CFU/g時，PMA-qPCR 方法定量獲得的檢測結(jié)果與平板計數(shù)獲得的結(jié)果一致性較好 （71.8%～91.5%，PMA-qPCR 檢測結(jié)果/平板計數(shù)結(jié)果×100）。當目標菌污染量小于103CFU/g，采用PMA-qPCR 方法檢測污染樣品時，平行樣品之間沒有明顯一致的陽性擴增信號，無法對樣品中的金黃色葡萄球菌進行定量。采用三重PMA-qPCR 方法篩查樣品中污染金黃色葡萄球菌是否攜帶腸毒素A 基因，僅當sea 基因陽性金黃色葡萄球菌污染量大于103CFU/g 時，可獲得準確的檢測結(jié)果。此外，當金黃色葡萄球菌污染量大于103CFU/g 時，雖然PMAqPCR 金黃色葡萄球菌定量結(jié)果普遍比平板計數(shù)獲得的定量結(jié)果低，但是配對T 檢驗結(jié)果表明兩者的結(jié)果并無顯著性差異。

圖4 PMA-qPCR 檢測體系在金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物（a）和速凍米面制品（b）中的熒光定量標準曲線Fig.4 The standard curves for quantification of Staphylococcus aureus in pure culture （a） and frozen foods （b）

表3 人工污染速凍面米制品中三重PMA-qPCR 和國標BP 平板法的金黃色葡萄球菌定量檢測結(jié)果Table 3 The enumeration results for Staphylococcus aureus in artificial contamination food samples by triplex qPCR method and plate count method

3 討論

Taqman 熒光定量PCR 技術(shù)，因其快速、靈敏的特點已成為食源性病原微生物檢測的重要手段[21]。目前已建立的金黃色葡萄球菌qPCR 檢測體系主要針對相對純凈的樣品（如培養(yǎng)基、牛奶）[22-23]，對qPCR 在復雜食品中的實際檢測能力缺少系統(tǒng)性評價。而研究表明復雜的食品基質(zhì)，如肉類、禽類及其加工產(chǎn)品等都是金黃色葡萄球菌污染的主要對象[24]。因此本研究針對基質(zhì)復雜的速凍面米食品（以米、面、雜糧等為主要原料，以肉類、蔬菜等為輔料），通過優(yōu)化樣品前處理方法，利用新發(fā)掘的金黃色葡萄球菌特異靶基因RpiR，建立了多重qPCR 檢測體系，可以準確定量金黃色葡萄球菌污染量大于103CFU/g 的速凍面米制品。目前我國國標GB 19295-2011 對速凍面米生制品和熟制品中金黃色葡萄球菌的最高安全限量值分別為104CFU/g 和103CFU/g，因此本研究建立的多重qPCR 檢測體系能夠滿足速凍面米食品中污染金黃色葡萄球菌的定量要求。

金黃色葡萄球菌食物中毒主要是由腸毒素造成的，而目前金黃色葡萄球菌的檢測多以檢出菌體為目的，忽視了對腸毒素的調(diào)查。而研究表明許多種腸毒素在100 ℃加熱處理30 min 后仍具有活性，特別是腸毒素A 在細菌數(shù)目比較低的時候也能產(chǎn)生，導致食物中毒[25]。本研究建立的三重qPCR 檢測體系在定量速凍面米食品中污染金黃色葡萄球菌的同時，也能夠檢測食品中污染金黃色葡萄球菌是否攜帶腸毒素A 基因。研究結(jié)果顯示，當食品樣品中腸毒素sea 基因陽性菌株污染量大于103CFU/g 時，三重qPCR 檢測體系可以準確篩查腸毒素sea 基因，評估食品中污染金黃色葡萄球菌的潛在致病風險。此外，食品基質(zhì)成分等PCR 抑制劑會造成qPCR 檢測的假陰性結(jié)果，大大限制了qPCR 技術(shù)的實際應用[15]。本研究在檢測體系中，添加了擴增內(nèi)標可以有效指示實際食品檢驗中的假陰性結(jié)果，在提高檢驗結(jié)果準確性的同時，增強了qPCR 檢測方法的實際應用價值。

速凍面米食品屬于冷凍食品，研究表明食品經(jīng)過冷凍能夠使食品中90%的微生物種群死亡[26]。而qPCR 技術(shù)是基于DNA 拷貝數(shù)來定量檢測細菌，因此有效消除死菌DNA 是qPCR 方法準確檢測細菌的前提。為達到檢測活菌的目的，光敏性核酸染料（PMA 和EMA）被用于修飾死菌核酸，抑制死菌核酸的擴增，與qPCR 聯(lián)合使用后，可以選擇性擴增活細胞DNA，提高檢測的準確有效性[7，27-28]。近年研究發(fā)現(xiàn)EMA 在一定條件下對活菌具有抑制作用，影響檢測結(jié)果的準確性[29]。而PMA 在質(zhì)量濃度大于30 μg/mL 時，則能夠完全抑制金黃色葡萄球菌死菌的擴增，而在質(zhì)量濃度小于50 μg/mL 時，不會對活菌檢測造成影響[19]。因此本研究選擇PMA 結(jié)合三重qPCR 檢測方法定量檢測速凍面米食品中污染的金黃色葡萄菌。采用人工污染速凍面米食品樣品，評價本研究建立的PMAqPCR 定量檢測性能，結(jié)果顯示，當金黃色葡萄球菌污染量大于103CFU/g 時，PMA-qPCR 定量檢測結(jié)果與國標平皿計數(shù)結(jié)果在對數(shù)值水平上具有較好的一致性，表明本研究建立的三重PMA-qPCR方法檢測結(jié)果準確可靠，可有效檢測速凍面米食品樣品中污染的金黃色葡萄球菌。

4 結(jié)論

本研究建立了能夠同時定量速凍面米食品中金黃色葡萄球菌，篩查腸毒素A 基因并指示PCR反應假陰性的三重PMA-qPCR 體系，該檢測方法操作簡便、特異性強，可以在5～6 h 內(nèi)，對食品中污染量在103～108CFU/g 范圍內(nèi)的金黃色葡萄球菌進行準確定量，同時篩查腸毒素A 基因，無論對食品工業(yè)生產(chǎn)流程中金黃色葡萄球菌的監(jiān)測和終產(chǎn)品質(zhì)量控制，還是對政府部門食品安全的管理和監(jiān)控都具有重要意義。