方炎鵬 張雙雙 藺 冀

（1 統(tǒng)一企業(yè)（中國）投資有限公司 上海200335 2 統(tǒng)一企業(yè)（中國）投資有限公司大陸研究所 江蘇蘇州215300）

酸菜[1]、榨菜[2]、雪里蕻[3]及蘿卜干[4]等發(fā)酵蔬菜制品是我國傳統(tǒng)的蔬菜加工品，因其獨特的風味而在我國及日本等國具有廣闊的消費市場[5]。發(fā)酵蔬菜制品在加工過程中因其原料、產(chǎn)地、加工工藝不同，故產(chǎn)生的重要揮發(fā)性成分也不同。榨菜、蘿卜干、酸白菜[6]等發(fā)酵蔬菜制品已有企業(yè)通過直投式菌種加快蔬菜的發(fā)酵成熟，確保產(chǎn)品的穩(wěn)定性和一致性。采用直投式發(fā)酵劑進行蕭山蘿卜干的發(fā)酵，與自然發(fā)酵相比，其揮發(fā)性成分的種類、數(shù)量和含量均超過自然發(fā)酵的蕭山蘿卜干。直投式菌種發(fā)酵四川泡菜，酯類等揮發(fā)性成分種類及相對含量接近，感官品評無顯著性差異。針對酸菜、榨菜、雪里蕻等蔬菜制品，研究人員對自然發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群進行分析[7]、菌種篩選[8]、鑒定等[9]研究。目前因生產(chǎn)受限于環(huán)境條件而未采用直投式菌種發(fā)酵蔬菜。截至發(fā)稿前，對兩者揮發(fā)性成分差異的研究較少。本文以酸菜為原料，采用固相微萃取與氣-質譜聯(lián)用技術（SPME-GC/MS），分析3種直投式菌種與自然發(fā)酵工藝中鹽漬酸菜和二次發(fā)酵階段酸菜的揮發(fā)性成分種類和含量的差異，為確定直投式菌種發(fā)酵酸菜產(chǎn)品的品質評價指標提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

參考文獻[10]的方法制備酸菜，分別取自然發(fā)酵鹽漬菜（KB）、直投式菌種-A（KHS，科漢森（中國）有限公司）、直投式菌種-B（SH，生合生物科技有限公司）和直投式菌種-C（GFJ，四川高福記生物科技有限公司） 發(fā)酵酸菜及二次發(fā)酵對應的酸菜樣品備用。

1.2 儀器與設備

氣-質譜聯(lián)用儀 （Varian Saturn 2000 & GC 3800），美國Varian 公司；573000-U 型固相微萃取手柄、固相微萃取探頭（50/30 μm 聚丙烯酸酯萃取頭），美國Supelco 公司。

1.3 取樣方法

稱取絞碎的4.00 g 樣品置于5 mL 微量萃取瓶中，采用固相微萃取法于50 ℃萃取35 min，用固相微萃取手柄將探頭送入萃取瓶中，推出探頭，使探頭置于樣品的上部，暴露30 min。

1.4 儀器分析條件

圖1 酸菜鹽漬/二次發(fā)酵工藝流程Fig.1 Salting/secondary fermentation process of pickled

色譜條件：30 m×0.25 mm×0.25 μm DBWAX色譜柱；爐溫250 ℃，不分流進樣；載氣為He，流速1.0 mL/min；升溫程序，從40 ℃以5 ℃/min 升溫到60 ℃，然后以6 ℃/min 升溫到140 ℃，最后以8℃/min 升溫到230 ℃，并保持6 min；FID 檢測器，檢測溫度260 ℃。質譜條件：70 eV EI 源，離子源溫度200 ℃；250 ℃進樣；掃描范圍33～450 u，掃描時間35 min。

1.5 數(shù)據(jù)處理

揮發(fā)性物質經(jīng)計算機檢索與MAINLIB、NISTDEMO、REPLIB 和WILLEY 等4 個譜庫確認定性，且各化合物峰面積的計算由軟件系統(tǒng)經(jīng)歸一化計算完成，以相對峰面積的大小表示各組分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 鹽漬段和二次發(fā)酵段酸菜的揮發(fā)性物質檢測

傳統(tǒng)酸菜加工過程中鹽漬段和二次發(fā)酵段的樣品揮發(fā)性成分的GC-MS 圖譜如圖2所示。各成分及相對含量見表1和表2。

圖2 鹽漬與二次發(fā)酵酸菜中揮發(fā)性成分的色譜圖Fig.2 Chromatography of volatile compounds during processing of pickled and secondary fermentation

發(fā)酵酸菜揮發(fā)性成分的來源一般有2 種途徑：一是新鮮芥菜發(fā)酵中揮發(fā)性前體物質的轉化，如氨基酸及纖維素的降解等；二是添加生鮮、香辛料、白酒可為酸菜二次發(fā)酵提供復合型的揮發(fā)性成分[11]。鹽漬段和二次發(fā)酵段酸菜的風味物質經(jīng)GC-MS 聯(lián)機分析后，各組分質譜經(jīng)計算機譜庫檢索，檢測出的揮發(fā)性物質主要包括烯類、醇類、醛類、酯類、揮發(fā)性酸和茴香精油類等6 類。

2.1.1 鹽漬階段直投式菌種與自然發(fā)酵酸菜揮發(fā)性成分的相對含量 由表1可知，鹽漬段直投式菌種與自然發(fā)酵酸菜均能檢測到乙酸乙酯、乳酸乙酯、異硫氰酸烯丙酯、辛酸乙酯4 種揮發(fā)性酯類，而直投式菌種與自然發(fā)酵方式的鹽漬酸菜差異較小，說明鹽漬段酯類物質的形成不局限于乳酸菌的作用[12]。整體而言，采用不同乳酸菌菌劑對芥菜進行鹽漬后的總體香氣風味物質排序為：KHS＞GFJ＞SH＞KB（空白對照），添加乳酸菌發(fā)酵后總體香氣均比空白對照的含量高，說明直投式菌種與自然發(fā)酵在鹽漬段整體風味物質相比無顯著性差異。具體特征性風味物質屬于乙酸乙酯、α-蒎烯、異硫氰酸烯丙酯及揮發(fā)性有機酸。

表1 鹽漬段直投式菌種與自然發(fā)酵酸菜揮發(fā)性成分的相對含量（%）Table 1 Relative content of volatile compounds during processing of pickled （%）

（續(xù)表1）

2.1.2 二次發(fā)酵階段直投式菌種與自然發(fā)酵酸菜揮發(fā)性成分的相對含量 由表2可知，二次發(fā)酵段直投式菌種與自然發(fā)酵酸菜相較于鹽漬段除均能檢測到乙酸乙酯、乳酸乙酯、異硫氰酸烯丙酯、辛酸乙酯4 種揮發(fā)性酯類外，增加了大量的d-苧烯、γ-松油烯，整體揮發(fā)性成分53 種（鹽漬段酸菜揮發(fā)性成分47 種），說明二次發(fā)酵時酸菜的揮發(fā)性成分種類及相對含量均有顯著提升，尤其是SH和GFJ 直投式菌種發(fā)酵酸菜在揮發(fā)性成分的相對含量與種類均比自然發(fā)酵更具優(yōu)勢，這點在泡菜中采用直投式菌種也得到相同結論，直投式菌種發(fā)酵泡菜與自然發(fā)酵對比無顯著性差異，品質更穩(wěn)定[13-14]。整體而言，采用不同乳酸菌菌劑對鹽漬酸菜進行二次發(fā)酵后的總體香氣風味物質排序為：SH＞GFJ＞KB（空白對照）＞KHS，添加SH 和GFJ乳酸菌發(fā)酵后總體香氣均比空白對照組的含量高，說明直投式菌種對鹽漬酸菜進行二次發(fā)酵，使得揮發(fā)性成分更豐富。具體特征性風味物質屬于乙酸乙酯、α-蒎烯、異硫氰酸烯丙酯、揮發(fā)性有機酸及茴香精油類化合物。

表2 二次發(fā)酵段直投式菌種與自然發(fā)酵酸菜揮發(fā)性成分的相對含量（%）Table 2 Relative content of volatile compounds during processing of secondary fermentation （%）

（續(xù)表2）

2.2 直投式菌種與自然發(fā)酵酸菜揮發(fā)性成分差異性評價

不同區(qū)域、不同工藝的蔬菜發(fā)酵后風味也存在差異，在發(fā)酵蔬菜工業(yè)化中，配方及工藝參數(shù)是品質穩(wěn)定的基本保障[15-16]，傳統(tǒng)采用二次發(fā)酵方式將風味進行重新修飾與平衡。鹽漬段和二次發(fā)酵段酸菜各類揮發(fā)性成分的相對含量分別見圖3和圖4。從圖3可以看出，直投式菌種與自然發(fā)酵酸菜揮發(fā)性成分中烯類、醇類、醛類、酯類、揮發(fā)性酸和茴香精油類化合物的種類差異不大。然而，將鹽漬菜采用直投式菌種與自然發(fā)酵方式進行二次發(fā)酵，由于加入少許香辛料、白酒、大蒜進行發(fā)酵，因此在二次發(fā)酵時酸菜的揮發(fā)性物質增加了二烯丙基硫醚、乙酸芳樟酯、α-松油烯、大茴香酸甲酯，而且茴香醇含量明顯提高。二次發(fā)酵后揮發(fā)性物質總量相對顯著增加，其中A（KHS 菌）樣品發(fā)酵的酸菜揮發(fā)性物質含量最高達105 668.1 ppb，增加了98 635 ppb 的揮發(fā)性物質。同時C（GFJ 菌）樣品的揮發(fā)性物質也對應增加了72 488 ppb，說明二次發(fā)酵時通過微生物與香辛料、白酒的相互作用，能在一定程度上起到提香的效果，對酸菜產(chǎn)品的風味及品質穩(wěn)定性起到重要作用。

圖3 鹽漬段酸菜揮發(fā)性成分的相對含量Fig.3 Relative content of volatile compounds during processing of salted pickle

圖4 二次發(fā)酵段酸菜揮發(fā)性成分的相對含量Fig.4 Relative content of volatile compounds during processing of secondary fermentation

3 結論

在酸菜鹽漬階段，直投式菌種發(fā)酵酸菜與自然發(fā)酵酸菜揮發(fā)性成分差異不顯著，3 種直投式菌種發(fā)酵酸菜總揮發(fā)性成分高于自然發(fā)酵酸菜；而在二次發(fā)酵階段，直投式菌種A（KHS）發(fā)酵樣品在感官香氣評分和揮發(fā)性成分總量均低于自然發(fā)酵酸菜，而直投式菌種B（SH）和直投式菌種C（GFJ） 發(fā)酵酸菜揮發(fā)性成分顯著高于自然發(fā)酵酸菜。酸菜鹽漬階段主要揮發(fā)性物質為乙酸乙酯、α-蒎烯、異硫氰酸烯丙酯及揮發(fā)性有機酸，而在二次發(fā)酵過程中，酸菜中酯類及醇類物質含量有所增加，揮發(fā)有機酸種類更加豐富，大幅增加了茴香性精油的含量。在酸菜鹽漬發(fā)酵階段和二次發(fā)酵階段分別檢測到揮發(fā)性物質47 種和53 種，揮發(fā)有機酸、酯類、醇類和烯類是酸菜中最重要的揮發(fā)性成分，可作為未來直投式菌種發(fā)酵酸菜品質評價指標。