邊燕飛 孫天松 孫志宏

（內蒙古農業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室農業(yè)部奶制品加工重點實驗室 呼和浩特010018）

近年來，越來越多的研究表明新生兒出生時已攜帶大量細菌。2014年，Ardissone 等[1]利用多路復用測序技術發(fā)現(xiàn)新生兒胎便中存在多種細菌DNA，其中含有腸球菌屬（Enterococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和腸桿菌屬（Enterobacter）。同年，郭賀[2]基于Illumina測序平臺對足月新生兒胎便菌群進行分析，發(fā)現(xiàn)胎便細菌在門水平上主要隸屬于變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），其中相對含量最高的菌屬包括擬桿菌屬（Bacteroides）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、梭菌屬（Clostridium）和鏈球菌屬（Streptococcus）。這些研究表明新生兒的腸道菌群在母體子宮內就已經開始建立，而隨后腸道菌群的發(fā)育和成熟是一個動態(tài)的非隨機過程，在此過程中，腸道菌群間發(fā)生相互促進和抑制作用，并受到各種條件的影響，如分娩方式、分娩時間、喂養(yǎng)方式和抗生素使用情況等。

分娩方式是新生兒腸道菌群建立的一個重要影響因素。多數(shù)研究認為新生兒在自然分娩過程中會直接接觸母體的陰道細菌，從而導致陰道相關微生物如乳桿菌屬和普氏菌屬（Prevotella）在新生兒腸道中定殖；相比之下，剖腹產是利用外科手術直接將胎兒從子宮內取出，失去了唯一能夠接觸產道的機會，更容易被來自母親皮膚、醫(yī)護人員或醫(yī)院的環(huán)境微生物定殖[3-4]。然而，這些研究主要是利用測序方法分析分娩方式對新生兒腸道菌群結構的影響，僅能對新生兒腸道菌群進行定性分析，無法定量分析。此外，隨著國家二胎政策的全面落實，以及晚婚晚育觀念的深入人心，高齡孕產婦的比例在逐漸增加，有研究發(fā)現(xiàn)高齡產婦與胎兒早產、畸形和死亡風險的增加有關，可能對新生兒的健康具有長期影響[5]，然而產婦生育年齡對新生兒腸道菌群影響的研究卻未見報道。微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）作為一種新型定量技術，其原理是利用微流體回路和表面活性劑將樣本預混液進行微滴化處理，制成油包水的分散微滴后進行PCR 擴增反應，并利用微滴分析儀對微滴逐個檢測，最終經軟件計算出目標DNA 分子的濃度。此技術具有靈敏度高，精確度高以及耐受性好等優(yōu)點，無需制備標準品即可直接獲得靶分子的濃度或拷貝數(shù)，能夠更加精確地對環(huán)境樣品中的微生物進行絕對定量分析[6]。

本研究采用微滴式數(shù)字PCR 技術，以14 份新生兒胎便樣品為研究對象，對樣品中細菌總數(shù)和腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬、普氏菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬（Lactococcus）、腸球菌屬以及大腸桿菌（Escherichia coli）這些核心菌群進行定量研究，旨在分析產婦的分娩方式和生育年齡對新生兒腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集 本研究的14 份新生兒胎便樣品均采自內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，新生兒均為足月分娩，其中7 名新生兒為自然分娩，7 名新生兒為剖腹產分娩；3 名新生兒所對應產婦為高齡產婦（年齡≥35），11 名新生兒所對應產婦為適齡產婦，新生兒 體重（3.0～3.95 kg）和身高（46～55 cm）正常。所有胎便樣品均采用常規(guī)和標準清潔技術在醫(yī)院采集，采集后的樣品立即以1∶1 的比例加入DNA 保護劑混勻，迅速低溫保存并轉移至實驗室-80 ℃冰箱備用。

1.1.2 試劑 Qiagen 糞便DNA 快速提取試劑盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit），德國QIAGEN 公司；RNA/DNA 保護劑 （Sample Protector for RNA/DNA），大連寶生物技術有限公司；QX200染料法預混液 （QX200 ddPCR EvaGreen Supermix）、QX200 探針法預混液（ddPCR Supermix for Probes）、染料法微滴發(fā)生專用油（QX200 Droplet Generation Oil）、探針法微滴發(fā)生專用油（Droplet Generation Oil for Probes）、微滴分析專用油（Droplet Reader Oil），美國Bio-Rad 公司。

1.2 儀器與設備

5810R 臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；HWS24 型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；ND-1000 型微量紫外分光光度計，美國Nano Drop 公司；微滴發(fā)生卡及密封墊、QX200 微滴發(fā)生器、96 孔板熱封儀、96 孔溫度梯度熱循環(huán)儀、微滴分析儀，美國Bio-Rad 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 胎便樣品宏基因組DNA 的提取 取0.5 g胎便樣品，利用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 試劑盒提取樣品中細菌宏基因組DNA，檢驗所提取DNA 的純度和濃度，將符合后續(xù)試驗要求的DNA 置于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2 胎便樣品核心菌群的定量研究

1） 將胎便樣品DNA、引物探針（10 nmol/L）以及預混液混合均勻，具體反應體系見表1。

表1 ddPCR 反應體系Table 1 The ddPCR reaction system

2） 將含有樣品DNA 的20 μL ddPCR 反應混合液和70 μL 微滴發(fā)生專用油轉移至微滴生成卡的指定位置，轉移時盡量輕柔，避免引入氣泡，液體轉移完畢后鉤牢膠墊兩邊的小孔。將微滴生成卡放入微滴發(fā)生器內，每個樣品將生成約20 000 個油包水的分散微滴，8 個樣品大約需2 min。

3） 將上述生成的約40 μL 微滴轉移至PCR反應板相應的孔內，用鋁膜封閉PCR 板，在96 孔板熱封儀內封膜，并在30 min 內進行PCR 擴增，擴增體系為：95 ℃10 min；95 ℃30 s，退火溫度40 s，40 個循環(huán)；4 ℃5 min，90 ℃5 min（染料法）/98 ℃10 min（探針法），具體引物探針序列如表2所示。

4） 將反應結束后的PCR 板直接放入微滴分析儀內，設置樣品信息后分析儀對每個微滴的熒光信號逐個檢測、分析，QuantaSoftTM分析軟件根據每個樣品中陽性微滴/總微滴的數(shù)目計算出目標菌的濃度（拷貝數(shù)/μL），每個樣品大約需1 min。

1.3.3 數(shù)據分析 計算胎便樣品中目標菌的定量結果，細菌定量結果lg（拷貝數(shù)/g）表示為平均值±標準偏差，采用Mann-Whitney 檢驗計算不同分組新生兒腸道中細菌絕對含量的差異顯著性，P＜0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義，并應用GraphPad Prism 6 軟件對胎便樣品的細菌定量結果作圖。

表2 目標菌特異性引物及擴增條件Table 2 Specific primers and amplification conditions of bacterial targets

2 結果與分析

2.1 不同分娩方式新生兒腸道核心菌群定量結果

圖1 不同分娩方式嬰兒腸道總菌的絕對含量Fig.1 Quantities of the total number of bacteria in meconium based on different delivery mode

本研究對14 名足月新生兒胎便中的細菌總數(shù)進行定量研究，發(fā)現(xiàn)所有新生兒胎便中均存在細菌，不同分娩方式新生兒胎便中的細菌總數(shù)定量結果如圖1所示，自然分娩和剖腹產新生兒每克胎便中的16S rRNA 基因拷貝數(shù)取對數(shù)后分別為：5.49±0.20 和5.23±0.14，不同分娩方式新生兒腸道總菌的絕對含量存在顯著差異，且自然分娩新生兒腸道總菌的含量顯著高于剖腹產新生兒（P＜0.05）。2016年，Rocio 等[18]利用DAPI 染色法對143 名不同分娩方式新生兒胎便中的細菌進行計數(shù)，結果同樣發(fā)現(xiàn)自然分娩嬰兒胎便中的細菌總數(shù)顯著高于剖腹產嬰兒。Huurre 等[19]利用熒光原位雜交技術研究嬰兒腸道微生物，結果發(fā)現(xiàn)1月齡自然分娩嬰兒腸道細菌的細胞總數(shù)平均值為9.9×109細胞/g，而剖腹產嬰兒腸道細菌的細胞總數(shù)平均值僅為3.1×109細胞/g，自然分娩嬰兒腸道總菌的數(shù)量同樣顯著高于剖腹產嬰兒；此外還發(fā)現(xiàn)自然分娩嬰兒外周血中的免疫球蛋白IgA、IgG和IgM 分泌細胞總數(shù)顯著低于剖腹產嬰兒，而這種抗體分泌細胞總數(shù)的差異可能是由于抗原過度暴露于脆弱的腸道中導致。事實上，共生菌與腸上皮組織相互作用形成黏膜屏障，在保護腸道免受損傷方面起主要作用。在正常平衡狀態(tài)下，共生菌和病原體被特異性toll 樣受體識別，并且共生菌和病原體在隨后的非炎癥和炎癥免疫反應之間存在差異。如果這種平衡被打破，那么腸上皮細胞可能以更快的速度增殖，使腸道防御屏障容易受到抗原的侵襲，這種抗原早期主要來源于食物和細菌[20]。因此，不同分娩方式可能通過影響嬰兒腸道菌群的發(fā)育，從而對嬰兒免疫功能產生影響。

為進一步具體分析是哪種細菌使得不同分娩方式新生兒腸道菌群含量的顯著差異，本試驗利用染料法對腸道核心菌群腸桿菌科、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬、普氏菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬進行定量研究。此外，鑒于在新生兒期，定殖在腸道中的大腸桿菌是新生兒感染的主要來源，因此本研究還利用探針法對大腸桿菌進行了定量研究。

通過對不同分娩方式新生兒腸道核心菌群的定量研究發(fā)現(xiàn)，腸桿菌科和乳桿菌屬在不同分娩方式新生兒胎便樣品中的絕對含量存在顯著性差異，而其它核心菌群的含量則無明顯差異，具體結果如圖2所示，腸桿菌科在自然分娩和剖腹產新生兒每克胎便中的基因拷貝數(shù)取對數(shù)后分別為：3.51±0.22 和3.26±0.17，自然分娩新生兒腸道腸桿菌科的含量顯著高于剖腹產新生兒（P＜0.05）。腸桿菌科作為成人典型的糞便細菌，新生兒胎便中存在的腸桿菌科常被認為是在分娩過程中受到母親糞便的偶然污染導致。2013年，Kabeerdoss 等[21]利用qPCR 技術對不同分娩方式新生兒腸道腸桿菌科進行定量分析，發(fā)現(xiàn)與自然分娩新生兒相比，剖腹產新生兒腸道中腸桿菌科的豐度較低，與本研究結果一致。因此自然分娩新生兒胎便中高含量的腸桿菌科應該不僅僅是由于偶然的糞便污染導致，而可能是受母親分娩方式的影響所致。

此外，乳桿菌屬在自然分娩和剖腹產新生兒每克胎便中的基因拷貝數(shù)取對數(shù)后分別為：3.76±0.46 和3.34±0.11，自然分娩新生兒腸道乳桿菌屬的絕對含量顯著高于剖腹產新生兒（P＜0.05）。目前已有大量研究報道顯示，乳桿菌屬是人體健康陰道微生物的主要組成部分，能夠產生大量乳酸為陰道提供一個酸性的環(huán)境，從而抑制病原菌的增殖或直接起到殺菌的作用，同時乳桿菌屬產生的過氧化氫可以抑制各種微生物的生長，維持陰道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡[22]。2017年，席曉霞[23]通過單分子實時測序技術對不同分娩方式新生兒胎便微生物進行研究后，發(fā)現(xiàn)自然分娩新生兒胎便樣品中的乳桿菌種類高達17 種，而剖腹產新生兒胎便中的乳桿菌種類僅有8 種，其中陰道的優(yōu)勢菌種卷曲乳桿菌在自然分娩新生兒胎便中的平均相對含量和檢出率均明顯高于剖腹產新生兒，而惰性乳桿菌和陰道乳桿菌在剖腹產新生兒胎便中未被檢出。2016年，Nagpal 等[24]利用RT-qPCR 技術同樣發(fā)現(xiàn)自然分娩新生兒腸道乳桿菌屬的定殖顯著高于剖腹產新生兒。更有研究發(fā)現(xiàn)這種顯著性差異即使在新生兒12 周齡時仍然存在[19]。因此，在自然分娩過程中，乳桿菌屬能夠由母親傳遞給新生兒，而且分娩方式影響了母嬰菌群的傳遞。

2.2 不同生育年齡產婦所生新生兒腸道菌群的定量研究

不同生育年齡產婦所生新生兒胎便中的細菌定量結果如圖3所示：適齡產婦和高齡產婦所生新生兒每克胎便中的16S rRNA 基因拷貝數(shù)取對數(shù)后分別為5.40±0.22 和5.25±0.15。其它腸道核心菌群的定量結果如下：腸桿菌科為3.40 ±0.26 和3.45 ± 0.22；乳桿菌屬為：3.59 ± 0.42 和3.40 ± 0.08；雙歧桿菌屬為：3.74 ± 0.42 和3.73 ±0.38；擬桿菌屬為：3.73±0.42 和3.73±0.38；梭菌屬為：2.93±1.03 和3.54±0.93；普氏菌屬為：4.09±0.44 和4.81 ± 0.73；鏈球菌屬為：2.57 ± 0.89和3.15 ± 0.49；乳球菌屬為：3.74 ± 0.25 和3.94± 0.19；腸球菌屬為：1.75±1.40 和1.49±2.58；大腸桿菌為：3.17±0.25 和3.23±0.32。

圖2 不同分娩方式新生兒腸道菌群的絕對含量Fig.2 Quantities of gut microbiota of infants based on different delivery mode

圖3 不同生育年齡產婦所生新生兒腸道菌群的絕對含量Fig.3 Quantities of intestinal microbiota of infants based on different childbearing age

通過差異性檢驗分析，發(fā)現(xiàn)鏈球菌屬在高齡產婦所生新生兒腸道中的絕對含量顯著高于適齡產婦所生新生兒（P＜0.05），而其它菌群的含量則無明顯差異。據報道，有流產史、生育年齡高等因素可導致孕產婦感染B 族鏈球菌的幾率增加，而B 族鏈球菌是圍產期嚴重感染性疾病的主要致病菌之一，可造成母嬰不良后果[25]。因此，母親不同生育年齡可能影響新生兒腸道鏈球菌屬的傳遞，而鏈球菌屬的增多是否與新生兒感染性疾病的發(fā)生有關需要進一步研究。

3 討論

本研究中不同分娩方式新生兒胎便樣品的核心菌群除腸桿菌科和乳桿菌屬以外其它菌屬均不存在顯著性差異，而Kuang 等[26]研究發(fā)現(xiàn)自然分娩新生兒胎便中的擬桿菌屬含量顯著高于剖腹產嬰兒，與本研究結果不一致。這一差異可能是由于所研究新生兒的性別不同，目前已有研究發(fā)現(xiàn)嬰兒腸道菌群的建立與性別相關，男性嬰兒胎便中的細菌總數(shù)顯著高于女性嬰兒[18]，另一項有關成年人性別對腸道菌群影響的研究也發(fā)現(xiàn)男性腸道中擬桿菌屬的定殖高于女性[27]，而本研究未采集新生兒的性別信息。此外，其它多項研究發(fā)現(xiàn)不同分娩方式嬰兒出生數(shù)天后糞便中的雙歧桿菌屬、普氏菌屬、梭菌屬和鏈球菌屬等存在差異[26，28-29]，這些差異可能受到嬰兒喂養(yǎng)方式的影響，一般情況下，母親在接受剖腹產手術后，很難對其嬰兒進行母乳喂養(yǎng)，因此，剖腹產嬰兒不能接受母乳喂養(yǎng)或者接受母乳喂養(yǎng)的時間比自然分娩嬰兒晚。多數(shù)研究只針對分娩方式或者喂養(yǎng)方式單一因素對嬰兒腸道菌群進行分析，Rocio 等[18]針對這一問題結合分娩方式和喂養(yǎng)方式兩種因素對嬰兒腸道菌群進行定量研究，發(fā)現(xiàn)自然分娩和母乳喂養(yǎng)有利于嬰兒腸道中加氏乳桿菌 （Lactobacillus gasseri）和兩歧雙歧桿菌 （Bifidobacterium bifidum） 的定殖，剖腹產分娩和配方奶粉喂養(yǎng)有利于羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）的定殖，而羅伊氏乳桿菌在剖腹產分娩和母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道中并不多見，因此嬰兒腸道羅伊氏乳桿菌、加氏乳桿菌和兩歧雙歧桿菌的存在受分娩方式和喂養(yǎng)方式的共同影響。除了分娩方式、喂養(yǎng)方式以外，其它影響嬰兒早期腸道菌群建立的因素還包括：抗生素的使用、出生的地理位置、家庭成員以及母親健康狀況等。據報道，接受抗生素治療后，嬰兒腸道細菌總數(shù)降低，其中雙歧桿菌屬和葡萄球菌屬的定殖減少，而且家庭成員中有兄姐的嬰兒早期腸道微生物多樣性和豐度會增加，其中鏈狀雙歧桿菌（Bifidobacterium catenulatum）的含量是頭胎嬰兒的9 倍多[18]。此外患有妊娠期2 型糖尿病的產婦所生嬰兒富集與患病產婦相同的糞便微生物菌群，而且胎便中微生物的α 多樣性，擬桿菌門（Bacteroidetes）和副擬桿菌屬（Parabacteroides）的相對含量高于健康產婦所生嬰兒[30]。Gosalbes 等[31]同樣發(fā)現(xiàn)胎便中檢測到的細菌類型受孕產婦健康狀況的影響，而且可能對嬰兒健康產生影響。胎便菌群結構能夠在一定程度上反映孕產婦的健康狀況，也與成長期嬰幼兒的健康水平密切相關，因此，深入探索這部分菌群的結構和功能或可為新生兒疾病的預防及治療帶來全新視角。

本研究對14 名新生兒進行重新分組后，發(fā)現(xiàn)共有11 名新生兒其母親屬于適齡產婦，3 名嬰兒其母親屬于高齡產婦，將所定量的菌屬含量進行差異性檢驗分析后發(fā)現(xiàn)，高齡產婦所生新生兒腸道中鏈球菌屬的絕對含量顯著高于適齡產婦所生新生兒，而在本研究中新生兒胎便中鏈球菌屬的含量不受分娩方式的影響。因此，產婦不同生育年齡可能影響新生兒腸道鏈球菌屬的傳遞。當然考慮到本研究適齡產婦與高齡產婦所生新生兒的數(shù)量差別較大，這一發(fā)現(xiàn)仍需要在兩組嬰兒數(shù)量相當?shù)难芯恐斜蛔C實，且今后嬰兒腸道菌群建立的相關研究中母親的生育年齡也應該作為被考慮的因素之一。

4 結論

本研究在14 份新生兒胎便樣品中均檢測到細菌，不同分娩方式新生兒腸道細菌總數(shù)存在顯著差異（P＜0.05），其中自然分娩新生兒腸道中腸桿菌科以及乳桿菌屬的絕對含量均顯著高于剖腹產新生兒（P＜0.05）；而高齡產婦所生新生兒腸道中鏈球菌屬的絕對含量顯著高于適齡產婦所生新生兒，表明產婦的分娩方式和生育年齡可能影響母嬰菌群的傳遞。同時，本研究所采用的微滴式數(shù)字PCR 技術具有高靈敏度的優(yōu)點，可用于新生兒腸道菌群的定量檢測。