遲 海 李學(xué)英 徐春霞 楊憲時 魯淑彥，3

（1 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所 上海200090 2 福建省閩東水產(chǎn)研究所 福建寧德352100 3 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海201306）

食品致病菌污染和繁殖一直是威脅食品安全的首要問題之一[1-2]。相關(guān)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國食源性疾病案例呈逐年上升的趨勢[3]。傳統(tǒng)食品企業(yè)解決食品致病菌殘留及污染的一般方式是改變加工工藝、高強度殺菌或添加化學(xué)抑菌物質(zhì)。然而，改變加工工藝或高強度殺菌不僅會破壞食品原有風(fēng)味，還可能使食品品質(zhì)下降，影響其營養(yǎng)價值。此外，化學(xué)抑菌劑殘留可能對人體造成潛在危害。而目前消費者對綠色安全和高效的抑菌物質(zhì)的需求越來越迫切。

細(xì)菌素是一種細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成而產(chǎn)生的一類抑菌肽[4]。由于乳酸菌普遍被人們定義為安全的微生物，因此，乳酸菌細(xì)菌素被認(rèn)作傳統(tǒng)化學(xué)抑菌物質(zhì)和抑制食品致病菌的綠色、高效代替品之一，并逐漸引起人們關(guān)注。目前，乳酸鏈球菌素（nisin）作為唯一通過FDA/WHO 認(rèn)證的細(xì)菌素，主要應(yīng)用于食品制品中[5]。然而，微生物耐藥性的進化使得耐nisin 的食品致病菌被檢出[6]。篩選具有廣譜抑菌性的乳酸菌并對其抑菌特性進行測定，對乳酸菌細(xì)菌素的發(fā)展和應(yīng)用有一定的意義。

本研究從市售豆腐乳中提取乳酸菌，以提取的乳酸菌為指標(biāo)菌，抑制3 種常見的食品致病菌（金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和蠟樣芽胞桿菌），篩選具有廣譜抑菌效果的乳酸菌。同時，通過對產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌分子、生理生化及抑菌機理進行研究，旨在鑒定新型綠色安全的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的作用效果，探索其抑菌機理，為抑制食品常見致病菌及乳酸菌的細(xì)菌素的發(fā)展、應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售豆腐乳，上海某超市。生理鹽水、甘油、營養(yǎng)瓊脂、乳酸菌培養(yǎng)基、M17 培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基、多粘菌素B、葡萄糖基均，國藥；API 50CH細(xì)菌糖代謝試劑盒，法國梅里埃公司；DNA 提取試劑盒，美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nano drop2000c 分光光度計、PCR 儀，美國thermo 公司；水平電泳槽及成像系統(tǒng)，美國biorad 公司；MP Fastprep-24 樣品處理儀，美國MP公司；酶標(biāo)儀Power Wave XS，美國伯騰儀器有限公司；YP200N 型天平，上海菁海儀器有限公司；HH.B11.500-BS-Ⅱ恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療機械廠；超凈工作臺SEX-TJ，上海整新電子設(shè)備。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的篩選 無菌條件下將10 g 豆腐乳研磨并溶解于90 mL 生理鹽水中，均質(zhì)2 min 后涂于預(yù)先添加多粘菌素B（0.5 g/L）的乳酸培養(yǎng)基中。無氧條件下于30 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，將生長于乳酸培養(yǎng)基的單菌落重新劃線，乳酸菌肉湯中30 ℃條件下培養(yǎng)過夜。通過革蘭氏染色[7]，過氧化氫酶反應(yīng)[8]和pH 值測定對乳酸菌進行篩選。將篩選好的乳酸菌劃線保存。

1.3.2 抑菌活性的測定 以3 株常見的食源性致病菌（金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和蠟樣芽胞桿菌）為指示菌，以分離的乳酸菌為指標(biāo)菌，使用瓊脂擴散法將100 μL 過夜的指示菌加入5 mL 腦心浸液培養(yǎng)基（含0.8%的營養(yǎng)瓊脂）中，搖勻后傾倒入腦心浸液培養(yǎng)基（含2.5%的營養(yǎng)瓊脂）。將3 μL 指標(biāo)菌點入腦心浸液培養(yǎng)基上，于有氧條件下30 ℃培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)基中呈明亮的抑菌圈被認(rèn)為指標(biāo)菌具有抑菌活性，否則被認(rèn)為不具有抑菌活性。保存具有抑制上述所有指示菌的潛在乳酸菌（指標(biāo)菌A），劃線保存以備后續(xù)試驗。

1.3.3 抑菌穩(wěn)定性的測定 將指標(biāo)菌A 在30 ℃培養(yǎng)10 h 后分別在不同條件（121 ℃10 min，100℃30 min 和90 ℃50 min）下進行熱處理。同1.3.2 節(jié)的方法，將3 μL 熱處理的指標(biāo)菌點入具有指示菌的培養(yǎng)基，并在指標(biāo)菌旁滴加1 μL 不同的酶試劑（20 μg/mL 的蛋白酶K 和1 mg/mL 的胰蛋白酶）。以滴加3 μL 未經(jīng)過上述處理的指標(biāo)菌為空白對照。培養(yǎng)基中呈明亮的抑菌圈被認(rèn)為指標(biāo)菌具有抑菌活性，否則被認(rèn)為不具有抑菌活性。

1.3.4 16 S rDNA 提取、PCR 擴增及菌種鑒定 指標(biāo)菌A 的基因組學(xué)DNA 使用Fastprep 將樣品打碎，并結(jié)合DNA 試劑盒提供的使用方法提取。PCR 擴增以指標(biāo)菌A 的基因組學(xué)DNA 為模版，使用OneTaq 酶試劑與上游引物5’-TAACACAT GCAAGTCGAACG-3’，下游引物5’-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3’建立25 μL 擴增體系。擴增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；進入PCR 循環(huán)階段后，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸20 s，共30 個循環(huán)；68 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取5 μL PCR 擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠下電泳，一定時間后觀測并記錄PCR 擴增產(chǎn)物。PCR 擴增產(chǎn)物使用試劑盒回收，20 μL 體系送樣檢測鑒定。

1.3.5 乳酸菌糖代謝能力測定 指標(biāo)菌A 對糖代謝能力使用API 50CH 試劑盒測定。試劑盒在30℃條件下培養(yǎng)24 h 后記錄顏色變化，48 h 后對顏色變化進行比對和確定。

1.3.6 細(xì)菌素抑菌范圍測定 以15 株不同菌屬為指示菌（其中包括3 株不同的產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌），采用1.3.2 節(jié)的方法。測定不同指示菌A 的抑菌范圍及能力。

1.3.7 基因組重復(fù)序列PCR 基因組重復(fù)序列PCR 采用Versalovic 等[9]方法。PCR 擴增以指標(biāo)菌A 的基因組學(xué)DNA 為模版，以5’-IIIICGICGI CATCIGGC-3’ 和5’-ICGICTTATCIGGCCTAC-3'分別為上下游引物，使用fusion 酶試劑，建立25 μL 擴增體系。擴增條件為：95 ℃預(yù)變性7 min；進入PCR 循環(huán)階段后，94 ℃變性1 min，41 ℃退火1 min，65 ℃延伸3 min，共35 個循環(huán)；65 ℃延伸16 min，4 ℃保存。取5 μL PCR 擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠下電泳，一定時間后觀測并記錄PCR 擴增產(chǎn)物。

1.3.8 乳酸菌細(xì)菌素抑菌機理 指示菌A 接種在5 mL 的乳酸菌肉湯中，30 ℃條件下培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)結(jié)束后，在9 000 r/min 條件下離心30 min。取上清液并在沸水中保溫15 min，冰上冷卻10 min 后將100 μL 上清液添加到在96 孔板中，以乳酸菌肉湯進行梯度稀釋。然后將100 μL 稀釋至50 倍體積的金黃葡萄球菌添加至96 孔板內(nèi)。30 ℃條件下，每隔一定時間內(nèi)測定OD600nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選

通過革蘭氏染色（陽性）、過氧化氫酶反應(yīng)（陰性）及乳酸菌肉湯pH 值（≤4.0）的測定，從市售豆腐乳中篩選出64 株乳酸菌。將全部乳酸菌作為指標(biāo)菌，篩選可以抑制常見的食源性致病菌的乳酸菌。結(jié)果篩選出4 株潛在產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌（命名為DH2001，DH2002，DH2003 和DH2004） 可以抑制所有的食源性致病菌。

細(xì)菌素的篩選一般通過抑制一株或特定指示菌，然而少量指示菌的選擇往往會對已知細(xì)菌素重復(fù)篩選。本試驗以3 株常見食品致病菌為特定指示菌，同時對產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的抑菌范圍能力進行測定，降低了對已知細(xì)菌素重復(fù)篩選的可能，而且達到篩選出具有廣譜抑菌能力的新型產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的要求。

2.2 乳酸菌細(xì)菌素穩(wěn)定性的測定

乳酸菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素一般定義為抑制特定細(xì)菌的短肽，具有熱穩(wěn)定強，易被蛋白酶分解，pH穩(wěn)定范圍廣[4]。表1是在不同條件下4 株乳酸菌細(xì)菌素的穩(wěn)定性結(jié)果。結(jié)果表明，4 株乳酸菌細(xì)菌素在熱處理后仍具有良好活性。同時，在酸性和中性條件下活性較堿性條件的活性高。最后，受蛋白酶處理后的乳酸菌細(xì)菌素全部失活。

微生物可以產(chǎn)多種抑菌物質(zhì) （如過氧化氫、酸、抗生素和細(xì)菌素等）[10]。不同于過氧化氫和酸，乳酸菌細(xì)菌素?zé)岱€(wěn)定性強，并易被蛋白酶分解；不同于傳統(tǒng)抗生素，乳酸菌細(xì)菌素一般具有抑菌用量低（毫微摩），專一性強，綠色高效等特點[11]。由于耐抗生素微生物不斷檢出，細(xì)菌素被認(rèn)為是取代抗生素的方法之一。重要的是，乳酸菌也普遍被認(rèn)為是安全的微生物。因此，乳酸菌細(xì)菌素具有廣泛的應(yīng)用前景。本試驗中，4 株乳酸菌細(xì)菌素經(jīng)高溫和強酸性處理后仍保持活性。這使得其在食品和藥品中具有巨大的應(yīng)用潛力。

表1 不同條件下乳酸菌細(xì)菌素穩(wěn)定性表現(xiàn)Table 1 Behaviors and stabilities of bacteriocin producers of lactic acid bacteria under different conditions

2.3 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定

以上述4 株潛在產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的基因組學(xué)DNA 為模版，進行PCR 擴增。PCR 擴增結(jié)果（圖1） 顯示在1.5 kb 處得到清晰的擴增產(chǎn)物條帶。PCR 擴增產(chǎn)物在回收處理后送樣對細(xì)菌進行鑒定。鑒定結(jié)果通過NCBI 數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)果顯示DH2001 為糞腸球菌 （Enterococcus faecalis），DH2002 為乳酸乳球菌（L.lactis），DH2003 為腸系膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），DH2004為乳酸乳球菌（L.lactis）。上述乳酸菌鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對相識度均達到99.9%。目前，由乳酸乳球菌、腸系膜明串珠菌和糞腸球菌產(chǎn)的細(xì)菌素研究較為廣泛，大量的細(xì)菌素也得到提取[12-16]。然而，試驗中是否獲得已知的細(xì)菌素仍需進一步研究。

圖1 4 株乳酸菌細(xì)菌素的PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 PCR products of four bacteriocin producers from lactic acid bacteria via agarose gel electrophoresis

通過對4 株乳酸菌糖代謝能力的測定結(jié)果顯示（表2），DH2001 和DH2003 對一些糖代謝能力較差，對密二糖、棉子糖和阿拉伯糖等不能代謝。DH2002 和DH2004 卻可以對這些糖進行代謝，而且二者對糖的代謝能力一致。

表2 4 株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌糖代謝比較Table 2 Comparisons on fermentation profile of four bacteriocins producers

2.4 4 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌抑菌能力測定

4 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的抑菌能力及范圍見表3。結(jié)果顯示，4 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的抑菌范圍較廣。抑菌范圍主要為革蘭氏陽性菌，包括與其親緣性較近的種屬（如戊糖片球菌）和常見的食品致病菌（如金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌和梭狀芽胞桿菌屬等）。而4 株乳酸菌對革蘭氏陰性菌無抑制作用。

研究選取產(chǎn)不同細(xì)菌素（Lcn G，nisin 和Lcn A/B/M）的3 株乳酸乳球菌（LFM2001、LFM2081 和LFM2032）作為指示菌。其主要目的是根據(jù)產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌有免疫系統(tǒng)[17]，乳酸菌不能被自己產(chǎn)生的細(xì)菌素所抑制或消除。選取產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌作為指示菌使得篩選過程中降低了篩選已知細(xì)菌素的幾率。DH2001 和DH2003 可以抑制所有已知產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，而DH2002 和DH2004 對產(chǎn)nisin 的乳酸菌無抑制作用，這說明DH2002 和DH2004 可能是產(chǎn)nisin 的乳酸乳球菌。加之二者抑菌范圍和糖代謝能力一致，16S rDNA 序列與產(chǎn)nisin A 的乳酸乳球菌基因組序列相似 （99.9%）。因此，認(rèn)為二者可能為同一株產(chǎn)nisin 的乳酸乳球菌，故只選用DH2002 進行后續(xù)試驗。

表3 4 株乳酸菌細(xì)菌素的抑菌能力比較Table 3 Comparisons on inhibition spectrum of four bacteriocins producers

2.5 基因組重復(fù)序列PCR

細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR 指紋技術(shù)具有高度的穩(wěn)定性，通過對PCR 擴增產(chǎn)物結(jié)果分析，可以比較細(xì)菌菌株的親緣關(guān)系、多樣性和差異性[18]。圖2為3 株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌基因組重復(fù)序列PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖譜。結(jié)果表示，3 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的PCR 擴增產(chǎn)物差異性較大，說明3 株乳酸菌的基因同源性較低。

2.6 細(xì)菌素抑菌機理

圖3是3 株乳酸菌細(xì)菌素初提物對金黃色葡萄球菌抑制作用機理。結(jié)果顯示，在12 h 里DH2001 和DH2002 可以完全抑制金黃色葡萄球菌。DH2003 在7 h 內(nèi)可以抑制金黃色葡萄球菌的生長，而7 h 后指示菌開始生長。通常情況下，不同細(xì)菌素根據(jù)抑菌機理不同，其主要抑菌方式有阻止細(xì)菌生長（Bacteriostatic）和殺滅細(xì)菌（Bactericide）兩種。根據(jù)試驗結(jié)果，DH2003 細(xì)菌素初提物只對金黃色葡萄球菌有暫時的抑制作用，而DH2001 和DH2002 對金黃色葡萄球菌完全抑制。乳酸菌細(xì)菌素的作用機理研究爭論較大，相關(guān)理論認(rèn)為乳酸菌細(xì)菌素可以隨機裂解細(xì)胞膜或在細(xì)胞膜上形成細(xì)孔，阻止/殺滅細(xì)菌生長[19]。而其它理論認(rèn)為乳酸菌細(xì)菌素是通過錨定細(xì)菌細(xì)胞膜上的特定蛋白作為受體，并作用于細(xì)胞膜從而形成核結(jié)構(gòu)，造成細(xì)菌死亡[10]。Nisin 抑菌機理的研究為后者的理論提供了科學(xué)依據(jù)。相關(guān)試驗顯示，nisin 通過N 末端錨定細(xì)胞膜上的lipid II，從而在細(xì)胞膜上形成核結(jié)構(gòu)，最后達到殺滅細(xì)菌的目的[20-21]。

目前，對于乳酸菌細(xì)菌素抑菌機理的作用只局限于5 種細(xì)菌素的研究[21-25]，限制了乳酸菌細(xì)菌素應(yīng)用于食品和藥品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究下一步旨在分析現(xiàn)有乳酸菌細(xì)菌素的特點并對其進行提取，最后研究其抑菌機理，為乳酸菌細(xì)菌素產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3 結(jié)論

圖2 3 株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 Repetitive-PCR products of three bacteriocin producers from lactic acid bacteria via agarose gel electrophoresis

圖3 3 株乳酸菌細(xì)菌素初提物對金黃色葡萄球菌抑制作用機理Fig.3 Model of action of three partial purified bacteriocins produced by lactic acid bacteria against S.aureus

本試驗通過從市售豆腐乳中篩選產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，并將其作用于食品中常見的致病菌，從而鑒定和分析產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的抑菌特性及作用機理。本研究從市售豆腐乳中獲取64 株乳酸菌，其中4 株乳酸菌可以同時抑制3 株食品常見致病菌（金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和蠟樣芽胞桿菌）。通過對這4 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的分子、生化和抑菌能力的測定，這4 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌分別鑒定為糞腸球菌（DH2001）、乳酸乳球菌（DH2002和2004）和腸系膜明串珠菌（DH2003）。4 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌對革蘭氏陽性菌具有廣譜的抑制作用，主要可以抑制厚壁菌門的相關(guān)種屬（如乳酸乳球菌、戊糖片球菌等），同時這4 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌對其它食品常見致病菌（如梭狀芽孢桿菌）也有一定抑制作用。然而，這4 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌對革蘭氏陰性菌無抑制作用。其中，DH2001 和DH2002 對金黃色葡萄球菌有完全抑制作用，DH2003 對金黃色葡萄球菌有阻止生長的作用。